COLORAZIONE NEGATIVA: LOGICA, TECNICA, VANTAGGI E SVANTAGGI - BIOLOGIA - 2025

La colorazione negativa è un metodo di colorazione speciale per evidenziare la presenza della capsula in alcuni microrganismi , principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae e Cryptococcus neoformans-, da campioni clinici o colture pure.

Il campione diretto comunemente utilizzato per applicare la colorazione negativa è il liquido cerebrospinale. Questa tecnica rappresenta una rapida alternativa per la diagnosi presuntiva di meningite, in particolare Cryptococcus neoformans.

A. Tartaro dentale macchiato con inchiostro di china, B. Cryptococcus neoformans var gatti debolmente incapsulato come si presenta in natura, utilizzando nigrosina. C. Cryptococcus neoformans var gatti con una capsula spessa come si trova nella sua forma parassitaria, utilizzando nigrosina. D. Cryptococcus neoformans con inchiostro di china leggermente diluito. Gisell Quinde, da Wikimedia Commons / CDC, tramite Wikimedia Commons / Crediti fotografici: Fornitori di contenuti: CDC / Dr. Leanor Haley, tramite Wikimedia Commons

Allo stesso modo, questa colorazione può essere applicata su espettorato e liquidi sterili in generale, nonché su ceppi ottenuti da giovani colture pure. Questa tecnica utilizza nigrosina o inchiostro di china per la sua esecuzione; si tratta quindi di una metodologia molto semplice ed economica da applicare che fornisce in breve tempo informazioni di grande valore diagnostico.

In questo senso, qualsiasi laboratorio è in grado di eseguire questa colorazione. Ovviamente il laboratorio deve disporre di personale competente in grado di riconoscere lieviti Cryptococcus neoformans isolati o in erba e differenziarli dai leucociti e dagli artefatti che il campione può presentare.

Base

Nigrosine e inchiostro di china funzionano in modo simile; pertanto, una delle due sostanze può essere utilizzata in modo intercambiabile.

Questa tecnica è chiamata colorazione negativa perché agisce in modo contrario al resto delle tecniche di colorazione. In questo, ciò che rimane incolore è la struttura che si cerca o che si vuole vedere; cioè microrganismi.

Pertanto, la colorazione si basa sulla colorazione del fondo dello striscio di un colore scuro. In questo scenario, le strutture capsulate risaltano di colore chiaro o incolore.

In generale, i lieviti sono resistenti, circondati da un alone chiaro che corrisponde alla capsula. Ciò si verifica perché l'inchiostro di china e la nigrosina sono sostanze incapaci di penetrare nel polisaccaride che costituisce la capsula dei microrganismi viventi.

Vale la pena notare che altre strutture che possono essere presenti nel campione diretto, come leucociti o globuli rossi, non penetrano neanche.

Tuttavia, se i microrganismi sono morti, il colorante può penetrare al loro interno, quindi questa colorazione è utile anche per valutare la vitalità dei microrganismi.

Tecnica

materiali

Nigrosina

La nigrosina deve il suo nome al colore nero che ha. È una sostanza sintetica che si ottiene riscaldando la miscela di composti organici -come nitrobenzina, anilina e anilina cloridrato-, utilizzando un catalizzatore (ferro o rame) in detta reazione.

Inchiostro cinese

L'inchiostro cinese è una sostanza usata principalmente dagli asiatici per scrivere, realizzare opere d'arte e dipingere monocromatiche. È molto popolare nella cultura cinese.

Si ottiene dal nero di seppia mischiato con carbone polverizzato, il prodotto della combustione di alberi poco resinosi.

È anche possibile prepararlo dalla fuliggine dell'incenerimento degli idrocarburi (oli vegetali), insieme ad una gelatina proteica che gli conferisce la giusta consistenza per evitare la precipitazione delle particelle di carbonio.

Specifiche per il campionamento

- Non richiede il digiuno.

- Il campione di CSF, espettorato o liquido sterile deve contenere almeno 1 ml di volume e deve essere trasferito immediatamente al laboratorio a temperatura ambiente.

- I campioni di CSF e di liquido sterile devono essere prelevati da un medico specializzato.

- Può anche essere una coltura pura di un ceppo sospetto legato ai suddetti patogeni.

Esecuzione della tecnica con campioni diretti

- I campioni devono essere centrifugati, quindi il supernatante viene scartato e il sedimento viene prelevato.

- Una goccia del materiale centrifugato (sedimento) e una goccia di inchiostro di china o nigrosina vengono poste su un vetrino pulito.

- Deve essere mescolato bene e coperto con un foglio di copertura, consentendo alla goccia di diffondersi come una pellicola sottile senza superare i bordi.

- Successivamente, il preparato viene montato sul microscopio.

- Se la preparazione è troppo scura, può essere diluita con acqua.

Esecuzione della tecnica con ceppi da coltura

- Una piccolissima porzione di una giovane cultura viene prelevata con un ago da seme e sciolta in una goccia di inchiostro di china precedentemente posta su un vetrino pulito.

- Un vetrino viene posizionato sopra.

- Si osserva al microscopio a 10X e poi a 40X.

Puoi anche sciogliere una parte della colonia in acqua distillata, e da lì prenderne una goccia e mescolarla con l'inchiostro di china. In questo modo, la preparazione non sarà così densa, consentendo di osservare le strutture in isolamento; se ci sono folle, non sarà ben osservato.

Un'altra metodologia è la seguente:

- Posizionare una goccia della coltura in sospensione su un'estremità del vetrino.

- Mettere una goccia di nigrosina sulla stessa estremità e mescolare.

- Con l'aiuto di un altro vetrino, distribuire il campione come se si stesse eseguendo uno striscio ematologico.

- Lasciar asciugare e osservare al microscopio.

Osservazione al microscopio

Devi prima concentrarti con un obiettivo 10X per avere un'ampia visuale del campo. Successivamente, va ricercato se ci sono spazi liberi; se ci sono, concentrati 40X per vedere i dettagli.

Vantaggio

- È facile da eseguire.

- È una tecnica poco costosa.

- Questo metodo non richiede che lo striscio sia fissato al calore o con prodotti chimici; pertanto, i microrganismi vengono osservati senza distorsioni.

- La preparazione fresca non ha bisogno di essere asciugata, quindi può essere osservata immediatamente, generando risultati rapidamente.

Svantaggio

Una volta montate, le preparazioni fresche devono essere osservate immediatamente; se si lasciano asciugare non è più possibile osservarli e occorre installarne uno nuovo.

Colorazione dei tessuti con inchiostro di china

Un'altra funzione che l'inchiostro di china può svolgere è nei laboratori di patologia. Questo viene applicato a campioni di tessuto estratti chirurgicamente per contrassegnare i margini di resezione del tumore.

Il tessuto segnato viene spruzzato con acido acetico. Questo agisce come un mordente e impedisce la fuoriuscita di inchiostro quando il tessuto viene sottoposto a trattamento di routine per la preparazione della biopsia.

La procedura consiste nel bagnare il tessuto in alcool e xilene, quindi immergerlo in cera di paraffina. Questa marcatura guida il patologo durante l'osservazione del tessuto, indicando dove si trova il margine di resezione chirurgica o altro punto di interesse.

Riferimenti

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