COLORAZIONE DI GRAM: LOGICA, MATERIALI, TECNICA E USI - BIOLOGIA - 2025

La colorazione di Gram è la tecnica di colorazione più semplice e più utile in microbiologia diagnostica. Questa tecnica fu creata dal medico danese Hans Christian Gram nel 1884, che riuscì a classificare i batteri come Gram positivi e Gram negativi, in base alla composizione della parete cellulare.

La tecnica ha subito alcune modifiche da parte di Hucker nel 1921 per stabilizzare i reagenti e migliorare la qualità della colorazione, motivo per cui la colorazione di Gram è nota anche come Gram-Hucker.

Vari strisci colorati con colorante Gram. A. Cocchi Gram positivi. B. Bastoncini Gram negativi. C. Bacilli Gram-positivi, polimorfonucleari e mononucleari. D. Lieviti.

Con questa tecnica è anche possibile osservare la forma dei microrganismi, cioè se sono cocchi, bacilli, coccobacilli, pleomorfi, filamentosi, tra gli altri. Così come la sua distribuzione nello spazio: in un ammasso, in una catena, isolato, a coppie, in tetradi, ecc.

Quando si sospetta un'infezione batterica, la maggior parte dei campioni ricevuti deve essere spalmata su un vetrino e colorati con Gram per l'esame microscopico.

Il rapporto Gram guiderà il medico su quale tipo di microrganismo può essere la causa dell'infezione, prima di ottenere il risultato finale della coltura.

In alcuni casi la vita del paziente è molto compromessa, quindi i medici necessitano urgentemente del referto Gram per effettuare un trattamento empirico, in attesa dell'identificazione del microrganismo.

Ad esempio, se il Gram rivela la presenza di cocchi Gram positivi nel liquido cerebrospinale, il medico guiderà la terapia iniziale con antibiotici che eliminano questo tipo di batteri, secondo i protocolli stabiliti per questo.

Una volta arrivato il risultato finale con il nome del microrganismo isolato e il suo rispettivo antibiogramma, il medico valuterà se modificare o meno la terapia. Questa decisione verrà presa in base allo studio della suscettibilità del microrganismo agli antibiotici che sta ricevendo e all'evoluzione del paziente.

Base

Questa è una tecnica che ha 4 passaggi fondamentali: colorazione, fissazione con il mordente, decolorazione e controcolorazione. Questa tecnica, quindi, oltre a colorare i batteri, permette anche di differenziarli.

Il viola cristallino è il primo colorante utilizzato. Ha un'affinità per il peptidoglicano e colorerà tutti i batteri presenti di viola, successivamente viene posto il lugol, che funge da mordente, cioè indurrà la formazione di complessi cristallo violetto-iodio insolubili all'interno della cellula. .

I batteri Gram positivi, che hanno una spessa parete di peptidoglicano, formano più complessi (cristallo violetto-iodio), quindi trattengono il colorante.

Inoltre, influisce anche sul fatto che la parete dei batteri Gram positivi contiene una maggiore quantità di acidi insaturi, che mostrano una grande affinità per gli agenti ossidanti (Lugol).

Nel frattempo, i batteri Gram negativi hanno un sottile strato di peptidoglicano, che fa sì che i batteri formino meno complessi di quelli Gram positivi.

Poi arriva la fase di decolorazione, in cui i batteri Gram positivi e Gram negativi si comportano in modo diverso.

I batteri Gram negativi contengono una membrana esterna ricca di lipopolisaccaridi che fa parte della loro parete cellulare. I grassi vengono distrutti dal contatto con l'alcol acetone, quindi la membrana esterna viene destabilizzata, rilasciando il cristallo viola.

Questo è il modo in cui viene quindi contrastato con safranina o fuchsin di base, diventando rosso.

Nel caso dei batteri Gram positivi, resistono allo sbiadimento perché la candeggina agisce chiudendo i pori, impedendo la fuoriuscita del complesso cristalvioletto / iodio.

Pertanto, la colorazione con violetto cristallino rimane stabile e non c'è spazio per safranina o fucsina. Questo è il motivo per cui questi batteri si colorano di blu intenso o viola.

materiali

Il set di colorazione di Gram è composto da:

• Vetro viola
• Lugol
• Alcol acetone
• Safranina o fucsina di base

Preparazione di coloranti e reagenti

Soluzione di violetto di cristallo

Soluzione a:

Cristallo viola ------------- 2 gr

Alcool etilico 95% ----------- 20cc

Soluzione B:

Ossalato di ammonio ----------- 0,8 gr

Acqua distillata ------------- 80 cc

Per la preparazione finale del cristalvioletto, la soluzione A deve essere diluita 1:10 con acqua distillata e miscelata con 4 parti di soluzione B. La miscela viene conservata per 24 ore prima dell'uso. Filtrare in una bottiglia color ambra usando carta da filtro.

La quantità da utilizzare quotidianamente viene trasferita in un flacone contagocce color ambra.

Iodo-Lugol

Pesare e misurare la quantità indicata di ogni composto, come segue:

Cristalli di iodio ------------- 1gr

Potassio ioduro ------------- 2gr

Acqua distillata ------------- 300 cc

Lo ioduro di potassio si scioglie poco a poco nell'acqua e poi si aggiunge lo iodio. La soluzione viene ridotta in una bottiglia color ambra.

La quantità da utilizzare quotidianamente viene trasferita in un flacone ambrato più piccolo con un contagocce.

Sbiancamento

Alcol etilico al 95% -----------– 50 ml

Acetone ------------------ 50 ml

È preparato in parti uguali. Coprite bene, poiché tende ad evaporare.

Mettere in un flacone contagocce.

Questa preparazione fornisce uno scolorimento in tempi moderati 5-10 secondi ed è la più consigliata.

I principianti preferiscono utilizzare solo alcol etilico al 95%, dove lo sbiadimento è più lento di 10-30 secondi.

Mentre i più esperti possono utilizzare acetone puro, dove lo scolorimento avviene molto rapidamente da 1 a 5 sec.

Contrasto

Soluzione madre di safranina

Safranina -------------– 2,5 gr

Alcool etilico 95% --------– 100 cc

Dopo aver pesato la quantità indicata di safranina, viene sciolta in 100 ml di alcol etilico al 95%.

La soluzione di lavoro di safranina viene preparata dalla soluzione madre.

Per fare questo, misurare 10 cc di soluzione madre, aggiungere 90 cc di acqua distillata per ottenere 100 ml.

Si consiglia di trasferire la quantità da utilizzare quotidianamente in un flacone color ambra con un contagocce.

I microrganismi che si colorano debolmente Gram-negativi con la colorazione di Gram-Hucker, come alcuni anaerobi, Legionella sp, Campylobacter sp e Brucella sp, possono essere colorati molto meglio usando la modifica di Kopeloff della colorazione di Gram-Hucker, chiamato macchia di Gram-Kopeloff.

Questa tecnica cambia il colorante safranina in fucsina di base. Con questa modifica è possibile colorare efficacemente i suddetti microrganismi.

Conservazione dei reagenti

I coloranti preparati devono essere conservati a temperatura ambiente.

Preparazione dello striscio del campione da colorare

Un campione deve contenere almeno 10 ⁵ microrganismi prima che sia probabile l'osservazione del microrganismo in uno striscio. Gli strisci possono essere ottenuti dal campione diretto o da colture in mezzi solidi o liquidi.

Gli strisci devono essere uniformi, ben distribuiti e non troppo spessi, per una migliore visualizzazione delle strutture presenti.

-Gramma di campioni diretti

Grammo di urina non centrifugata

L'urina viene miscelata e 10 µl vengono posti su un vetrino. L'osservazione di almeno un batterio / campo Dip indica che c'è un'infezione.

Ciò significa che la coltura avrà approssimativamente più di 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) di urina nell'85% dei casi.

Questo metodo non è utile per conteggi di colonie inferiori a 100.000 CFU.

CSF Gram

Il CSF deve essere centrifugato, il surnatante rimosso e il pellet distribuito su un vetrino. Questo liquido è sterile in condizioni normali; l'osservazione dei batteri indica un'infezione.

Grammo di campioni respiratori

L'espettorato Gram, il lavaggio bronchiale o broncoalveolare, sebbene possa essere presente una varietà di microrganismi, guiderà sempre la diagnosi, oltre ad essere utile il tipo di cellule osservate.

In caso di espettorato, lo striscio deve essere preparato con le porzioni più purulente del campione.

Grammo di feci

Non è consigliabile eseguire un Gram su questo tipo di campioni, poiché non ha valore diagnostico.

-Gram di colture

Possono essere eseguiti in due modi, uno da colture liquide e l'altro da colture solide.

Colture liquide

Dalle culture liquide è estremamente semplice; Diverse tostature del brodo torbido vengono portate sotto il fuoco e poste su un vetrino pulito e asciutto, facendo movimenti circolari dal centro verso la periferia, per distribuire uniformemente il materiale.

Lascia asciugare spontaneamente all'aria. Una volta asciutto, il materiale viene fissato alla lastra con il calore. Per fare questo, con l'aiuto di una pinzetta, si fa passare la sfoglia 3-4 volte attraverso la fiamma del becco Bunsen, facendo attenzione a non bruciare il materiale.

Il foglio viene lasciato raffreddare e viene posizionato sul ponte colorante.

Colture solide

Per eseguire uno striscio per la colorazione di Gram da una coltura solida, procedere come segue:

Prima di scegliere le colonie da prelevare, preparare il vetrino, versando circa due gocce di soluzione salina fisiologica sterile.

Se la piastra di coltura originale contiene diversi tipi di colonie, verrà scelta una colonia isolata di ciascuna per eseguire il grammo. Ciascuna colonia sarà prelevata con l'ansa in platino da sciogliere nella soluzione salina precedentemente posta sul vetrino.

I movimenti circolari vengono effettuati dal centro verso la periferia, per distribuire in modo omogeneo la colonia sul vetrino.

Lascia asciugare spontaneamente all'aria. Una volta asciutto, il foglio viene fissato con il calore, come spiegato in precedenza (fiammeggiando il vetrino con l'accendino), facendo attenzione a non bruciare il materiale.

Questa procedura deve essere eseguita con ogni diverso tipo di colonia. Su un foglio di carta va annotato l'ordine di ciò che si osserva, ad esempio:

Colonia 1: colonia gialla beta-emolitica: cocchi Gram positivi sono stati osservati in gruppi

Colonia 2: Colonia color crema, senza emolisi: sono stati osservati coccobacilli Gram negativi.

Ogni diapositiva deve essere etichettata per sapere cosa stiamo osservando.

Tecnica

La tecnica di colorazione di Gram è estremamente facile da eseguire e relativamente economica e non può essere persa in un laboratorio di microbiologia.

È fatto come segue:

1. Fissare lo striscio con il calore e posizionarlo sul ponte di colorazione.
2. Coprire completamente il vetrino con crystal violet per 1 minuto.
3. Risciacquare con acqua Non asciugare
4. Coprire la sfoglia con la soluzione di lugol, lasciare agire 1 minuto. Risciacquare con acqua Non asciugare.
5. Candeggiare per 5-10 secondi agitando delicatamente in alcol acetone. Oppure, posizionare il foglio in posizione verticale e far cadere le gocce del decolorante sulla superficie fino a rimuovere l'eccesso di vetro viola non trattenuto. Non superare.
6. Risciacquare con acqua Non asciugare.
7. Sostituire il vetrino sul ponte di colorazione e coprire per 30 secondi con safranina (Gram-Hucker) o 1 minuto con fucsina di base (Gram-Kopeloff).
8. Lavare con acqua
9. Lasciar asciugare all'aria spontaneamente in posizione verticale.

Una volta asciutto, posizionare 1 goccia di olio da immersione per osservarlo sotto l'obiettivo 100X nel microscopio ottico.

Utilità

Questa tecnica permette di distinguere le differenze morfotintoriali della maggior parte dei batteri.

Anche i lieviti si distinguono per questa colorazione. Prendono il violetto cristallino, cioè si colorano di Gram positivi.

D'altra parte, si possono distinguere bastoncini Gram-positivi che formano spore, in cui si osserva uno spazio chiaro all'interno del bacillo, dove si è formata l'endospora, sebbene le spore non si colorino bene. Altre tecniche come Shaeffer-Fulton vengono utilizzate per colorare le spore.

Va notato che questa colorazione non viene utilizzata per colorare tutti i tipi di batteri, cioè ci sono casi in cui la colorazione non funziona.

In questo caso si possono citare batteri privi di parete cellulare. Ad esempio: genere Mycoplasma, sferoplasma, ureaplasma, forme L e protoplasti.

Colora anche molto male i batteri con pareti ricche di acidi micolici, come i micobatteri, e batteri intracellulari come le clamidie e le rickettsie.

È anche inefficace nella colorazione della maggior parte dei batteri spirochetali.

Ci sono batteri dello stesso genere che possono essere osservati nello stesso campione di Gram positivi e Gram negativi. Quando ciò accade si parla di colorazione di Gram variabile, che può essere dovuta all'alterazione dei nutrienti, della temperatura, del pH o della concentrazione di elettroliti.

Errori comuni

Sbiancamento esagerato

L'esagerazione nella fase di decolorazione può portare all'osservazione di falsi microrganismi Gram negativi.

Non attendere un tempo di asciugatura sufficiente per aggiungere l'olio da immersione

Può causare la colorazione dei batteri Gram positivi (falsi Gram negativi). Ciò accade perché nelle vecchie colture è probabile che ci siano batteri morti o viziati e in queste condizioni i batteri non trattengono il violetto cristallino.

Usa una soluzione lugol molto vecchia:

Con il tempo il lugol perde le sue proprietà e il suo colore sbiadisce. Se si utilizza il reagente già degenerato, non fisserà bene il violetto cristallino, quindi c'è la possibilità di ottenere una visualizzazione di microrganismi falsamente Gram negativi.

Sfondo blu

Uno sfondo adeguatamente scolorito sarà rosso. Uno sfondo blu indica che lo scolorimento era insufficiente.

Riferimenti

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