Rose Bengal è un test di laboratorio basato su una reazione antigene-anticorpo per la diagnosi di brucellosi. La tecnica consente la rilevazione di anticorpi specifici contro il batterio Brucella abortus in campioni di siero umano. Il risultato può essere riportato qualitativamente o semiquantitativamente.
La forma qualitativa esprime se il paziente è positivo o negativo per il test, cioè se ci sono o meno anticorpi. Nel frattempo, il rapporto semiquantitativo è riportato in UI / ml e indica la quantità approssimativa di anticorpi presenti. Va notato che gli anticorpi verranno prodotti solo se il paziente è stato in contatto con il microrganismo.
Reazione di rosa bengala in una piastra di agglutinazione. Fonte: tratto dal video https://youtu.be/igAVQ-GiyGY
Per la sua grande semplicità, elevata sensibilità e specificità, è una delle tecniche di sieroagglutinazione più utilizzate in medicina come test iniziale per la diagnosi di questa malattia.
Alcuni ricercatori hanno confrontato l'efficacia del test Rose Bengal con altre tecniche, come la seroagglutinazione (antigeni febbrili) e hanno osservato che sebbene vi sia una buona correlazione, hanno visto casi isolati in cui il test dell'antigene febbrile era negativo e Rose de Flare positivo.
La differenza ottenuta era dovuta al fatto che questi pazienti avevano una sottoclasse di anticorpi IgG contro Brucella abortus con migliore capacità di legame a pH acido, pertanto potevano reagire con il reagente Rose Bengal ma non con quello degli antigeni febbrili.
In questo senso, hanno suggerito che i reagenti della tecnica dell'antigene febbrile siano modificati a pH acido in modo che possano rilevare questo tipo di caso.
Base
Il Rose Bengal Reagent è costituito da una sospensione antigenica. È costituito dal ceppo S99 di Brucella abortus, diluito in un tampone lattato acido (pH 3,6), più fenolo e colorante Rose Bengal.
Pertanto, nel campione si cercano gli anticorpi anti-Brucella, se presenti reagiranno con l'antigene reagente e si osserverà una reazione di agglutinazione macroscopicamente visibile. Il test rileva gli anticorpi IgM o gli anticorpi IgG.
Ciò significa che può rilevare la malattia sia nella sua fase acuta in cui prevalgono gli anticorpi IgM sia nella sua fase cronica in cui predominano gli anticorpi IgG.
Questo rappresenta un vantaggio in quanto aumenta la sensibilità del test, ma allo stesso tempo è uno svantaggio poiché non discrimina tra uno stadio e l'altro, perché la reazione con gli anticorpi IgM e IgG è identica.
Il test deve essere sempre eseguito insieme a un controllo negativo e un controllo positivo. Il controllo negativo contiene siero animale senza anticorpi e il controllo positivo contiene siero di origine animale con 50 UI / ml di anticorpi anti-Brucella.
Uso
La brucellosi è una malattia grave che tende ad essere cronica e pericolosa, quindi è molto importante che venga diagnosticata precocemente. È una zoonosi e gli esseri umani possono essere infettati dal contatto diretto con materiale contaminato, le persone più vulnerabili sono veterinari e custodi di animali.
L'infezione può anche verificarsi mangiando carni crude infette, tra le altre forme di infezione.
Questa malattia attacca localmente o sistemicamente. La forma sistemica è la più grave, poiché possono essere colpiti vari organi, tra cui il sistema endoteliale del reticolo (fegato, milza, midollo osseo), la pelle (cellulite e linfoadenopatia), il sistema respiratorio (polmonite), il sistema muscolo-scheletrico (artrite, sacroileite e spondilite), tra gli altri.
Il test Rose Bengal è una tecnica molto utile per effettuare uno screening iniziale, perché è molto economico, di facile utilizzo, e ha una grande specificità e sensibilità.
I casi di falsi negativi e falsi positivi sono molto rari e possono verificarsi in soggetti con titoli anticorpali molto bassi (<25 UI / ml) o estremamente alti (> 1000 UI / ml) rispettivamente.
Processi
materiali
-Rose Bengala Kit
-Piastra di agglutinazione sfondo bianco
-50 µl pipetta
-Rotatore (opzionale)
-Vortice
Tecnica (metodo qualitativo)
I kit commerciali di Rose Bengala vengono forniti con reagenti pronti per l'uso.
-Temperare i reagenti prima di iniziare a lavorare.
-Le piastre di agglutinazione hanno cerchi disegnati, ciascuno per un campione diverso. Utilizzare 3 cerchi, il primo per il controllo negativo, il secondo per il campione e il terzo per il controllo positivo.
-Posizionare una goccia o 50 µl dei controlli e del campione nel cerchio corrispondente.
-Mescolare il reagente Rose Bengal utilizzando un vortice. Posizionare una goccia accanto a quelle precedentemente posizionate.
-Mescolare con stuzzicadenti di legno (usarne uno per ogni campione o controllo). Fai movimenti circolari e allarga in modo da coprire l'intero cerchio.
Fonte: immagini tratte dal video: https://youtu.be/igAVQ-GiyGY. Layout dell'immagine modificata.
-Posizionare la piastra su un rotatore automatico da 80 a 100 RPM o ruotare manualmente per 4 minuti. Leggi la prova alla fine di questo periodo.
-Verificare che i controlli abbiano dato come previsto. Confrontare la reazione del campione di prova con i controlli. Segnalare come positivo se si osserva agglutinazione e come negativo se non c'è agglutinazione.
Un test positivo indica che il paziente ha una quantità pari o superiore a 25 UI / ml di anticorpi anti-Brucella.
Interpretazione di una reazione positiva (con agglutinazione) e negativa (senza agglutinazione). Fonte: citrullina. Immagine modificata.
Tecnica (semiquantitativa)
Se nella reazione qualitativa il campione è fortemente positivo, può essere semi-quantificato. Per questo vengono effettuate doppie diluizioni seriali del campione con soluzione salina fisiologica. La procedura precedentemente descritta viene eseguita ad ogni diluizione.
Viene anche interpretato osservando macroscopicamente l'agglutinazione. Il risultato sarà il titolo della diluizione più alta in cui è stato osservato un risultato positivo.
Per calcolare il valore approssimativo degli anticorpi anti-Brucella, viene utilizzata la seguente formula:
25 UI / ml x titolo di reazione = UI / ml
Esempio, se un paziente nel test semiquantitativo risulta positivo alla diluizione ½, ¼ e 1/8 e inizia a essere negativo dalla diluizione 1/16 in poi, significa che il paziente ha un titolo di 8 .
Applicare la formula:
25 UI / ml x 8 = 200 UI / ml
QA
-I kit hanno una data di scadenza e deve essere rispettata. Non deve essere utilizzato se il reagente è scaduto.
-Durante l'uso, assicurarsi che il reagente non contenga particelle solide, poiché questo è un segno di deterioramento.
-Mantenere tra 2 e 8 ° C.
-Non congelare, questo atto danneggia irrimediabilmente il reagente.
-Effettuare sempre il test insieme ai controlli negativo e positivo.
-La tecnica tollera campioni di siero con un certo grado di lipemia ed emolisi, tuttavia si sconsiglia di utilizzare sieri eccessivamente lipemici ed emolizzati, entrambe le condizioni alterano i risultati del test.
-Portare sempre i reagenti a temperatura ambiente prima di iniziare l'analisi.
-Non interpretare reazioni che durano più a lungo del tempo consigliato, poiché questo genera la segnalazione di falsi positivi, poiché dopo un certo tempo il reagente precipita simulando una reazione positiva.
-La tecnica è sensibile al 100% e ha una specificità del 98%.
-Dopo una semi-quantificazione di 1000 UI / ml c'è la possibilità di osservare un effetto prozona (falso negativo dovuto ad un eccesso di anticorpo rispetto alla quantità di antigeni).
Riferimenti
- Rubio M, Barrio B e Díaz R. Valore dei test Rosa de Bengala, Coombs e contro-immunoelettroforesi per diagnosticare casi di brucellosi umana in cui l'agglutinazione sierica è negativa. Dipartimento di Microbiologia. Servizio di microbiologia clinica. Clinica universitaria. Università di Navarra. 406-407. Disponibile su: elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas
- "Brucellosi." Wikipedia, l'enciclopedia libera. 6 dicembre 2019, 14:37 UTC. 18 dicembre 2019, 18:09 en.wikipedia.org.
- Laboratori Monlab. Monlab Bengal Rose - prova. 2016, disponibile su: monlab.es/
- Carrillo C, Gotuzzo E. Brucellosis. Rev. Perù. Med. Exp. Public Health 1997; 14 (1): 63-66. Disponibile su: scielo.org
- Morales-García R, García-Méndez N, Regalado-Jacobo D, López-Merino A, Contreras-Rodríguez A. Follow-up clinico, sierologico e della reazione a catena della polimerasi di una famiglia con brucellosi. Rev. chil. Infectol. 2014; 31 (4): 425-433. Disponibile su: scielo.conicyt.