BRODO MALONATO: FONDOTINTA, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2025

Il brodo malonato è il terreno di coltura liquido utilizzato per il test diagnostico (malonato), utilizzato per differenziare alcuni generi della famiglia delle Enterobacteriaceae. È stato creato da Leifson nel 1933 e successivamente modificato da Ewing, che ha aggiunto una piccola quantità di destrosio ed estratto di lievito alla formula originale.

Il terreno è attualmente composto da estratto di lievito, solfato di ammonio, fosfato dipotassico, fosfato monopotassico, cloruro di sodio, malonato di sodio, destrosio e blu di bromotimolo. Questo test è generalmente incluso nella batteria di identificazione biochimica per Enterobacteriaceae, aiutando a differenziare alcuni generi e specie.

Rappresentazione grafica del test del malonato. A. Test negativo, B. (Acidificazione) Test negativo, C. (Medio alcalinizzazione) Test positivo. Fonte: tubi colorati publicdomainpictures.net

Il test del malonato si basa principalmente sulla capacità di alcuni microrganismi di utilizzare il malonato di sodio come unica fonte di carbonio e il solfato di ammonio come fonte di azoto.

Il test del malonato è generalmente positivo in alcune specie dei generi Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Mentre la maggior parte delle specie dei generi Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providencia, danno una reazione negativa.

Base

Il test del malonato consiste nel mostrare quei batteri che sono in grado di utilizzare il malonato di sodio come unica fonte di carbonio e il solfato di ammonio come fonte di azoto.

La maggior parte delle Enterobacteriaceae che non utilizzano il malonato sono in grado di crescere in questo terreno, assumendo destrosio ed estratto di lievito come nutrienti.

In questo caso, qualsiasi tentativo di alcalinizzazione mediante l'uso di peptoni sarà contrastato dalla produzione di acidi generati dalla fermentazione del destrosio. Allo stesso modo, i fosfati dipotassici e monopotassici fungono da tampone, mantenendo il pH a 6,7.

Ecco perché, quando il test è negativo, il brodo rimane dello stesso colore originale (verde). In rare occasioni il terreno può diventare acido a causa della fermentazione del destrosio; senza l'uso dei peptoni e dell'indicatore di pH virerebbe il colore del terreno verso il giallo. Perché ciò avvenga, il pH deve scendere a 6.

Tuttavia, quando questo test è positivo, si dice che il microrganismo ha utilizzato malonato e solfato di ammonio rispettivamente come fonti di carbonio e azoto, senza fare uso degli altri componenti.

In questo caso il mezzo diventa alcalino per il rilascio di sodio e la conseguente formazione di NaOH. In questo senso, l'indicatore di pH (blu di bromotimolo) trasforma il colore del mezzo da verde a blu quando il pH è uguale o superiore a 7,6. Il blu può essere chiaro o intenso (blu di Prussia).

Infine, il cloruro di sodio mantiene l'osmolarità del mezzo e l'acqua è il diluente di tutti i componenti.

Interpretazione

Brodo dello stesso colore (verde) - Test negativo

Brodo giallo: test negativo

Brodo blu chiaro o profondo: risultato positivo

Esiste una variante chiamata brodo di fenilalanina malonato, chiamata anche terreno di Shaw e Clarke. In questo caso si possono analizzare due test, l'utilizzo del malonato come fonte di carbonio e la produzione di acido piruvico dalla fenilalanina.

Preparazione

Brodo di malonato

Viene pesato il numero di grammi specificato dall'inserto dell'azienda commerciale prescelta (può variare da uno all'altro). I grammi pesati vengono sospesi in un litro di acqua distillata. Riscaldare leggermente fino a completa dissoluzione. Distribuire 3 ml del terreno in 13/100 provette con tappi di cotone.

Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15-20 minuti.

Raffreddare prima dell'uso. Se non verranno utilizzati immediatamente, conservare in frigorifero fino al momento dell'uso. Portare i brodi a temperatura ambiente prima di inoculare.

Il pH del mezzo dovrebbe essere 6,7 ± 0,2. Il colore del terreno preparato è verde bottiglia.

Brodo di fenilalanina malonato

Pesare 11 g del terreno disidratato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. Il resto della preparazione è lo stesso descritto in precedenza.

Può anche essere preparato aggiungendo 2 g / L di fenilalanina al mezzo di brodo malonato prima che sia sterilizzato.

Uso

Viene utilizzato come parte della batteria di test biochimici che vengono assemblati per l'identificazione dei batteri della famiglia delle Enterobacteriaceae.

Aiuta a distinguere tra:

-Il genere Klebsiella e Enterobacter (+) del genere Escherichia e Serratia (-).

-Le specie Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), della specie Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Dal genere Klebsiella generalmente (+) dal genere Actinobacillus (-).

-Occasionalmente può aiutare la differenziazione di generi e specie di batteri non appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae, come tra i bacilli Gram negativi non fermentanti Alcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).

Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.

Processi

Sotto un accendino, viene prelevata una porzione di acqua di colonia pura, utilizzando un manico di platino adeguatamente sterilizzato e raffreddato. Il campione prelevato (inoculo leggero) viene sciolto nel brodo malonato. Incubare con il coperchio allentato in aerobiosi a 35 ° C ± 0,2 per 24-48 ore.

Il brodo di malonato può anche essere inoculato da una coltura di 18-24 ore in brodo di soia tripticasi. In questo caso si prendono 0,01 ml con una pipetta sterile e si inocula il brodo di malonato. Incubare con il coperchio allentato in aerobiosi a 35 ° C ± 0,2 per 24-48 ore.

Alla fine del tempo, i risultati vengono interpretati. Qualsiasi traccia di colore blu dopo 48 ore di incubazione deve essere considerata positiva. Il test non deve essere interpretato come negativo fino al termine del tempo di incubazione di 48 ore.

Nel caso di utilizzo della variante brodo fenilalanina malonato, si interpreta prima il malonato e poi si aggiungono 5 gocce di HCl 1N e 3-5 gocce di cloruro ferrico all'8%. Un colore verde scuro è interpretato come un test positivo per la fenilalanina. Se, d'altra parte, il terreno diventa blu pallido, il test è negativo per la fenilalanina.

QA

Per eseguire il controllo di sterilità del terreno, incubare uno o due brodi a 35 ° C ± 0,2 per 24 ore di incubazione. Trascorso questo tempo non dovrebbe esserci nuvolosità o cambiamento di colore.

Per il controllo di qualità possono essere utilizzati ceppi noti o certificati, come: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 ed Escherichia coli ATCC 25922.

I risultati attesi sono:

• Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Salmonella enterica ssp arizonae danno una reazione positiva (colore blu medio).
• Per Escherichia coli, il risultato dovrebbe essere negativo, cioè si prevede che non ci sarà alcun cambiamento di colore (verde) o che diventerà giallo a causa della fermentazione del glucosio.

limitazioni

Non utilizzare brodo che mostri torbidità, precipitati, viraggio di colore o qualsiasi segno di deterioramento.

Riferimenti

1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Isolamento microbiologico di Salmonella spp. e strumenti molecolari per la sua rilevazione. Uninorte Health. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponibile su: scielo.org.co
2. BBL. Brodo di malonato, modificato Ewing. 2007. Disponibile su: bd.com
3. Senna Laboratories. Brodo di malonato. Disponibile su: cientificasenna.com
4. RenyLab. Brodo di malonato. 2013, disponibile su: es.renylab.ind.br
5. Mbiolog Diagnostics. Brodo di malonato. Disponibile su: mbiolog.com
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
7. Laboratori Conda Pronadisa. Brodo di fenilalanina malonato. Disponibile su: condalab.com