COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN: LOGICA, REAGENTI E TECNICA - BIOLOGIA - 2025

La Ziehl-Neelsen una tecnica di colorazione per identificare i microrganismi resistenti all'alcool acido (ARA). Il nome di questa procedura microbiologica si riferisce ai suoi autori: il batteriologo Franz Ziehl e il patologo Friedrich Neelsen.

Questa tecnica è un tipo di colorazione differenziale, che implica l'uso di coloranti differenti per creare contrasto tra le strutture che si vogliono osservare, differenziare e successivamente identificare. Il colorante Ziehl-Neelsen viene utilizzato per identificare alcuni tipi di microrganismi.

Colorazione Ziehl-Neelsen

Alcuni di questi organismi sono micobatteri (es. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (es. Nocardia sp.) E alcuni parassiti unicellulari (es. Cryptosporidium parvum). Molti dei batteri possono essere classificati attraverso una tecnica comune chiamata colorazione di Gram.

Tuttavia, alcuni gruppi batterici richiedono altri metodi per essere in grado di identificarli. Tecniche come la colorazione Ziehl-Neelsen richiedono combinazioni di coloranti con il calore per fissare i primi alla parete cellulare.

Poi arriva un processo di sbiancamento che consente due risultati: resistenza o sensibilità allo scolorimento da acidi e alcoli.

Base

La motivazione di questa tecnica di colorazione si basa sulle proprietà della parete cellulare di questi microrganismi. Il muro è costituito da un tipo di acidi grassi chiamati acidi micolici; Questi sono caratterizzati dall'avere catene molto lunghe.

Quando gli acidi grassi hanno strutture molto lunghe, possono trattenere i coloranti più facilmente. Alcuni generi batterici sono molto difficili da colorare con la colorazione di Gram, a causa dell'alto contenuto di acidi micolici nella parete cellulare.

Il colorante Ziehl-Neelsen utilizza il composto fenolico carbol fuchsin, un colorante di base. Questo ha la capacità di interagire con gli acidi grassi della parete cellulare, che ha una consistenza cerosa a temperatura ambiente.

La colorazione di carbol fuchsin è migliorata in presenza di calore, poiché la cera si scioglie e le molecole del colorante si muovono più rapidamente nella parete cellulare.

L'acido che viene utilizzato successivamente serve per scolorire le cellule che non erano macchiate perché la loro parete non era sufficientemente correlata al colorante; pertanto, la forza della candeggina acida è in grado di rimuovere il colorante acido. Le cellule che resistono a questa decolorazione sono chiamate acido-resistenti.

Colorante secondario

Dopo la decolorazione del campione, viene contrastato con un altro colorante chiamato colorante secondario. Generalmente viene utilizzato blu di metilene o verde malachite.

Il colorante secondario colora il materiale di fondo e di conseguenza crea contrasto con le strutture che sono state macchiate nella prima fase. Solo le cellule scolorite assorbono il secondo colorante (controcolorazione) e assumono il loro colore, mentre le cellule acido-resistenti mantengono il loro colore rosso.

Questa procedura è spesso utilizzata per l'identificazione di Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, che sono chiamati bacilli acido-resistenti.

Reagenti

Colorante primario

Viene utilizzato lo 0,3% di carbol fuchsin (filtrato). Questo colorante viene preparato da una miscela di alcoli: fenolo in etanolo (90%) o metanolo (95%), e in questa miscela vengono sciolti 3 grammi di fucsina basica.

Soluzione sbiancante

In questa fase è possibile utilizzare soluzioni di acido alcolico al 3% o acido solforico al 25%.

Colorante secondario (contro-colorante)

Il colorante più utilizzato per contrastare i campioni è solitamente lo 0,3% di blu di metilene. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri, come lo 0,5% di verde malachite.

Tecnica

Procedura di colorazione acido-rapida

Prepara uno striscio batterico

Questa preparazione viene eseguita su un vetrino pulito e asciutto, seguendo le precauzioni di sterilità.

Asciugatura delle macchie

Lascia asciugare lo striscio a temperatura ambiente.

Riscalda il campione

Il campione deve essere riscaldato applicando il fuoco alla diapositiva sottostante. Una fissazione con alcol può essere eseguita quando lo striscio non è stato preparato con espettorato (trattato con ipoclorito di sodio per sbiancarlo) e se non si macchia immediatamente.

M. tuberculosis viene rimosso con candeggina e durante il processo di colorazione. La fissazione con il calore dell'espettorato non trattato non ucciderà M. tuberculosis, mentre la fissazione con alcol è battericida.

Copri la macchia

La macchia viene ricoperta con la soluzione di carbol fuchsin (colorante di base primario).

Riscalda la macchia

Questo viene fatto per 5 minuti. Dovresti notare un'evoluzione del vapore (circa 60 ° C). È importante non surriscaldare ed evitare di bruciare il campione.

Per quanto riguarda il riscaldamento della macchia, è necessario prestare molta attenzione nel riscaldare il carbol fuchsin, soprattutto se la colorazione viene eseguita su un vassoio o altro contenitore in cui sono stati raccolti prodotti chimici altamente infiammabili della colorazione precedente.

Applicare solo una piccola fiamma sotto i vetrini utilizzando un tampone precedentemente acceso inumidito con alcune gocce di alcol acido, metanolo o etanolo al 70%. Evitare di utilizzare un tampone grande imbevuto di etanolo poiché questo è un pericolo di incendio.

Lava la macchia

Questo lavaggio deve essere effettuato con acqua pulita. Se l'acqua del rubinetto non è pulita, lavare lo striscio con acqua filtrata o distillata, preferibilmente.

Copri lo striscio con alcool acido

Questo alcol acido dovrebbe essere al 3%. La copertura viene eseguita per 5 minuti o fino a quando lo striscio non è sufficientemente scolorito, cioè di colore rosa pallido.

Va tenuto presente che l'alcol acido è infiammabile; pertanto, deve essere utilizzato con molta cura. Evitare di essere vicino a fonti di accensione.

Lava la macchia

Il lavaggio deve essere effettuato con acqua distillata pulita.

Copri lo striscio con la macchia

Può essere colorato con verde malachite (0,5%) o blu di metilene (0,3%) per 1 o 2 minuti, utilizzando il tempo più lungo se lo striscio è sottile.

Lava la macchia

Anche in questo caso deve essere utilizzata acqua pulita (distillata).

Per drenare

Il retro del vetrino deve essere pulito e la macchia posta su una griglia per asciugare all'aria (non utilizzare carta assorbente per l'asciugatura).

Esaminare lo striscio al microscopio

È necessario utilizzare l'obiettivo 100X e l'olio da immersione. Scansiona lo striscio sistematicamente e registra le osservazioni pertinenti.

Interpreta i risultati

Teoricamente, i microrganismi che macchiano un colore rossastro sono considerati positivi acido-resistenti (AAR +).

Al contrario, se i microrganismi si colorano di blu o di verde, a seconda del colorante utilizzato come contro-colorante, sono considerati acido-resistenti negativi (AAR-).

Riferimenti

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