MEDIO DI: LOGICA, PREPARAZIONE, USI E LIMITAZIONI - BIOLOGIA - 2025

Il terreno di fermentazione OF o glucosio è un agar semisolido appositamente progettato per lo studio del metabolismo ossidativo e fermentativo dei carboidrati in un importante gruppo di microrganismi diversi dalle Enterobacteriaceae, chiamati bacilli Gram negativi non enterici.

È stato creato da Hugh e Leifson; questi ricercatori si sono resi conto che i mezzi convenzionali per studiare la produzione di acido dai carboidrati non erano adatti a questo specifico gruppo di batteri.

A. Mezzo OF basale commerciale. B. Tubi con semi di media OF. Fonte: A e B Foto scattate dall'autore MSc. Marielsa Gil.

Questo perché i bastoncini Gram negativi non enterici generalmente producono basse quantità di acidi, a differenza delle Enterobacteriaceae.

In questo senso, il mezzo OF ha caratteristiche speciali in grado di rilevare le piccole quantità di acido formate, sia per via ossidativa che fermentativa. Queste differenze sono legate alla quantità di peptoni, carboidrati e agar.

Questo terreno contiene meno peptoni e una maggiore concentrazione di carboidrati, riducendo così i prodotti che alcalinizzano il mezzo a causa del metabolismo proteico e aumentando la produzione di acidi dovuta all'uso di carboidrati.

D'altra parte, la diminuzione della quantità di agar favorisce la disseminazione dell'acido prodotto in tutto il terreno, oltre a permetterci di osservare la motilità.

Il terreno OF è costituito da peptone, cloruro di sodio, blu di bromotimolo, fosfato dipotassico, agar e un carboidrato. Il carboidrato più comune è il glucosio, ma altri possono essere utilizzati in base al quale si vuole studiare, come il lattosio, il maltosio, lo xilosio, tra gli altri.

Base

Come ogni terreno di coltura, il terreno OF deve contenere sostanze nutritive che garantiscano la crescita batterica; queste sostanze sono peptoni.

Il carboidrato da parte sua fornisce energia e allo stesso tempo serve a studiare il comportamento del microrganismo nei suoi confronti, cioè permette di classificare i batteri come organismi ossidativi, fermentativi o non saccarolitici.

Il mezzo OF contiene un rapporto peptone / carboidrato 1: 5 rispetto ai terreni convenzionali 2: 1. Ciò garantisce che la quantità di ammine alcaline formate dalla degradazione dei peptoni non neutralizzi la formazione di acidi deboli.

D'altra parte, il mezzo contiene cloruro di sodio e fosfato dipotassico. Questi composti stabilizzano osmoticamente il mezzo e regolano rispettivamente il pH. Il blu di bromotimolo è l'indicatore di pH, che trasforma il colore del mezzo da verde a giallo con la produzione di acido.

Alcuni microrganismi possono utilizzare i carboidrati attraverso le vie ossidative o fermentative, mentre altri non prendono nessuna delle due strade.

Questo dipende dalle caratteristiche di ciascun microrganismo. Ad esempio, alcuni microrganismi aerobici severi possono ossidare alcuni carboidrati e gli anaerobi facoltativi possono ossidarsi e fermentare a seconda dell'ambiente circostante, mentre altri non ossidano o fermentano i carboidrati (asacarolitici).

Infine, c'è una modifica del mezzo OF raccomandato dal CDC che contiene una base OF speciale con rosso fenolo come indicatore.

Processo di ossidazione

Il processo di ossidazione del glucosio non richiede la fosforilazione del glucosio, così come il processo di fermentazione. In questo caso il gruppo aldeidico viene ossidato a un gruppo carbossilico, dando luogo ad acido gluconico. Questo a sua volta viene ossidato a 2-chetogluconico.

Quest'ultimo si accumula o si scompone in due molecole di acido piruvico. Questo sistema richiede la presenza di ossigeno o di un composto inorganico come accettore finale di elettroni.

La produzione di acidi attraverso questa via è più debole di quella ottenuta dalla via della fermentazione.

Processo di fermentazione

Affinché la fermentazione del glucosio avvenga attraverso una qualsiasi delle vie disponibili, deve prima essere fosforilata, diventando glucosio-6-fosfato.

La fermentazione del glucosio può prendere diverse strade, la principale è la via Embden-Meyerhof-Parnas, ma possono anche prendere la via Entner-Doudoroff, o la via Warburg-Dickens esoso monofosfato, conosciuta anche come la via della degradazione dei pentosi.

La via scelta dipenderà dal sistema enzimatico che il microrganismo possiede.

Via Embden-Meyerhof- Parnas

Nella fermentazione del glucosio per via Embden-Meyerhof-Parnas, viene scisso in due molecole di triosio, per poi essere degradato a vari composti carboniosi, fino alla formazione della gliceraldeide-3-fosfato. Da lì ha origine una sostanza intermedia, che è l'acido piruvico.

Da lì si formeranno vari tipi di acidi misti che possono variare da una specie all'altra.

Questo sistema si verifica in assenza di ossigeno e richiede un composto organico come accettore di elettroni finale.

Sentiero Entner-Doudoroff

Nella fermentazione del glucosio attraverso la via Entner-Doudoroff, il glucosio 6-fosfato diventa glucono-ᵼ-lattone-6-fosfato e da lì viene ossidato a 6-fosfogluconato e 2-cheto-3-deossi-6- fosfogluconato, per formare infine acido piruvico. Questo percorso ha bisogno di ossigeno perché avvenga la glicolisi.

Via di degradazione dei pentosi o via del monofosfato Warburg-Dickens Hexoxa

Questo percorso è un ibrido dei 2 precedenti. Inizia in modo simile alla via Entner-Doudoroff, ma successivamente si forma la gliceraldeide-3-fosfato come precursore dell'acido piruvico, come avviene nella via Embden-Meyerhof-Parnas.

Preparazione

Pesare:

2 g di peptone

5 g di cloruro di sodio

10 g di D-glucosio (o il carboidrato da preparare)

0,03 g di blu di bromotimolo

3 gr di agar

0,30 g di fosfato dipotassico

1 litro di acqua distillata.

Mescolare tutti i composti tranne il carboidrato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. Scaldare e agitare fino a completa dissoluzione.

Raffreddando a 50 ° C si aggiungono 100 ml di glucosio al 10% (filtrato).

Distribuire in modo asettico 5 ml di terreno OF in provette con tappo di cotone e autoclavare a 121 ° C, 15 libbre di pressione per 15 minuti.

Lasciar solidificare in posizione verticale.

Il pH del terreno dovrebbe essere 7,1 Il colore del terreno preparato è verde.

Conservare in frigorifero.

applicazioni

Il mezzo OF è un mezzo speciale per determinare il comportamento metabolico di un microrganismo nei confronti di un carboidrato. Soprattutto per quelli che formano acidi piccoli, deboli o nulli.

Sown

Per ogni microrganismo sono necessarie 2 provette OF, entrambe devono essere inoculate con il microrganismo da studiare. La colonia viene presa con un'impugnatura dritta e si fora al centro del tubo senza raggiungere il fondo; È possibile eseguire diverse forature, a condizione che non vi sia interesse per l'osservazione della motilità.

Uno strato di vaselina liquido sterile o paraffina fusa sterile (da 1 a 2 ml circa) viene aggiunto a una delle provette ed etichettato con la lettera "F". L'altro tubo è lasciato originale ed etichettato "O". Entrambe le provette vengono incubate a 35 ° C e osservate quotidianamente per un massimo di 3-4 giorni.

Interpretazione

Metabolismo e produzione di gas

Tabella: Classificazione dei microrganismi in base al loro comportamento in tubi OF aperti (ossidativi) e chiusi (fermentativi)

Fonte: realizzato dall'autore MSc. Marielsa gil

Il gas viene osservato con la formazione di bolle o lo spostamento dell'agar.

Va notato che un organismo che ossida solo il glucosio ma non lo fermenta, non sarà in grado di fermentare altri carboidrati, in ogni caso lo ossiderà solo. Pertanto, in questa situazione verrà omesso il tubo sigillato per lo studio di altri carboidrati.

motilità

Inoltre, la motilità può essere vista nel mezzo OF.

Motilità positiva : crescita che non si limita all'area di inoculazione. C'è una crescita verso i lati del tubo.

Motilità negativa : crescita solo nell'inoculo iniziale.

QA

I seguenti ceppi possono essere utilizzati come controlli di qualità: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Moraxella sp. I risultati attesi sono:

1. coli: fermentatore del glucosio (sia tubi gialli che frizzanti).
2. aeruginosa: ossidante del glucosio (tubo giallo aperto e sigillo verde o blu).
3. Moraxella sp: Non saccarolitico (tubo aperto verde o blu, tubo verde sigillato).

limitazioni

-Alcuni microrganismi non possono crescere nel mezzo OF. In questi casi, il test viene ripetuto ma al terreno viene aggiunto il 2% di siero o lo 0,1% di estratto di lievito.

-Le reazioni di ossidazione sono spesso osservate solo vicino alla superficie e il resto del terreno può rimanere verde, allo stesso modo è considerato positivo.

Riferimenti

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
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5. Laboratori Conda Pronadisa. DI mezzo di glucosio. Disponibile su: condalab.com
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