MEZZI DI CULTURA: STORIA, FUNZIONE, TIPI, PREPARAZIONE - BIOLOGIA - 2024

I terreni di coltura sono preparati nutrizionali speciali per il recupero, l'isolamento e il mantenimento di microrganismi batterici e fungini. Questi supporti possono essere solidi, liquidi o semisolidi.

Louis Pasteur fu il primo a dimostrare che in un brodo a base di pezzi di carne bolliti si usava far riprodurre i batteri in gran numero, al punto da appannare il brodo. In questo senso, il brodo di carne di Pasteur è considerato il primo mezzo di coltura liquido utilizzato.

Terreni di coltura grezzi e preparati (solidi e liquidi). Fonte: Flickr

Poi Robert Koch, con l'aiuto dei suoi collaboratori Julius Richard Petri e Walter Hesse, fece passi da gigante. Il primo ha progettato la capsula di Petri, che è ancora utilizzata oggi; e il secondo gli venne in mente di sostituire la gelatina con l'agar-agar per preparare terreni di coltura solidi, il che era molto rilevante, poiché la gelatina era degradata da alcuni microrganismi.

Attualmente esistono molte classi di terreni di coltura con finalità diverse, pertanto, questi vengono classificati in base alla loro funzione: tra i più importanti possiamo citare i terreni di coltura nutritivi, selettivi, differenziali, di trasporto, di arricchimento e di conteggio. colonie, mantenimento e test di sensibilità.

Alcuni terreni di coltura sono speciali per l'osservazione delle reazioni chimiche, essendo molto utili per l'identificazione del microrganismo coinvolto. Tra questi possiamo citare: Kligler medium, MIO, LIA, citrate, tra gli altri.

Storia

Il primo mezzo di coltura è stato preparato da Louis Pasteur quando ha cercato di dimostrare che la vita microbica non era il prodotto della generazione spontanea, ma che i microrganismi potevano moltiplicarsi e anche che provenivano dall'aria.

Preparò un brodo con pezzi di carne e osservò che dopo pochi giorni dall'esposizione all'aria diventava torbido e c'era una quantità apprezzabile di microrganismi nel brodo. Allo stesso tempo, un altro brodo con pezzi di carne precedentemente bolliti e sigillati ermeticamente è rimasto traslucido con il passare dei giorni.

Questo ha attirato l'attenzione di molti ricercatori che si sono resi conto che questi microrganismi erano responsabili della decomposizione della carne e anche della causa di alcune malattie.

Per questo motivo era fondamentale creare un modo per riprodurre questi microrganismi in laboratorio al fine di studiarli ulteriormente.

In questo senso, Robert Koch ha dato un contributo inestimabile al miglioramento di alcune tecniche di laboratorio, in particolare quelle relative all'isolamento batterico, introducendo il concetto di terreno di coltura solido.

All'inizio ha usato le fette di patate come mezzo solido ma in seguito ha aggiunto la gelatina ai brodi di carne con risultati migliori. Tuttavia, c'erano momenti in cui la gelatina si scioglieva e si trasformava in una coltura liquida. Oggi è noto che ciò accade perché alcuni batteri sono in grado di idrolizzare la gelatina.

Fu allora che uno dei suoi collaboratori ebbe l'idea di usare l'agar-agar, un composto che sua moglie usava per addensare i suoi dolci.

Questo mezzo di cultura rudimentale è diventato gradualmente più sofisticato, fino a raggiungere i mezzi di cultura che sono conosciuti oggi.

Composizione

Ogni mezzo ha una composizione diversa, ma è essenziale che contenga i nutrienti specifici per un buon sviluppo del tipo di microrganismo ricercato.

Può anche contenere sostanze chimiche specifiche che aiutano a rivelare il percorso metabolico di un certo ceppo o che mostrano la presenza di determinati enzimi.

Un altro elemento importante è l'uso di sostanze tampone. Questi aiutano a mantenere l'equilibrio osmotico dei media, così come il pH.

Possono anche contenere carboidrati e un indicatore di pH per mostrare la fermentazione dello zucchero aggiunto. Si osserverà un cambiamento di colore del terreno in caso di acidificazione generata dalla fermentazione.

Alcuni terreni di coltura contengono sostanze inibitorie. A seconda della sostanza utilizzata, la crescita di alcuni microrganismi sarà limitata e quella di altri sarà favorita.

Tipi di mezzi di coltura

I terreni di coltura sono classificati in base a vari criteri. Questi sono: in base alla sua consistenza, alla sua composizione e alla sua funzione.

- Secondo la sua consistenza

liquidi

Non contengono agar-agar. La crescita batterica o fungina è evidenziata dalla torbidità del brodo, che originariamente è traslucido.

Solido

Contengono tra l'1,5 e il 2% di agar-agar. La miscela solidificata ha una superficie che resiste al fine movimento del manico in platino senza romperlo.

Semi-solido

Contengono circa lo 0,5% di agar-agar, quindi è uno stato intermedio tra liquido e solido. Ideale nei media che servono a vedere la motilità. Sono inoltre consigliati per la conservazione dei ceppi, in quanto mantengono l'umidità molto più a lungo.

Bifasico

Sono mezzi preparati in modo tale che ci sia una fase solida e su questa un mezzo liquido. Ampiamente usato per emocolture.

- Secondo la sua composizione

Terreni di coltivazione naturali

Sono sostanze prese direttamente dalla natura per coltivare i batteri, fornendo loro un ambiente il più vicino a come si sviluppano normalmente nell'ecosistema. Esempio, latte, succhi, sangue diluito, siero, ecc.

Terreni di coltura sintetici

Sono i più utilizzati oggi, sono i mezzi disidratati che acquistiamo nelle case commerciali e di cui è nota tutta la loro composizione chimica, poiché sono stati strategicamente progettati in base al tipo di microrganismo da isolare.

Terreni di coltura semisintetici

È la combinazione di un mezzo sintetico a cui viene aggiunto un elemento naturale per arricchire il mezzo.

Terreni di coltura cellulare

Sono mezzi speciali per la crescita di virus, poiché questi microrganismi non sono in grado di sopravvivere alle cellule esterne, devono contenere tessuti o cellule viventi di un animale o di una pianta.

Esempio: colture cellulari di rene di scimmia o uova embrionate.

- Secondo la sua utilità

Terreni nutritivi, selettivi, differenziali, trasporto, arricchimento, identificazione, quantificazione delle colonie, mantenimento e test di sensibilità. Verranno descritti in seguito.

Funzione

Indipendentemente dal tipo di mezzo di coltura, hanno tutti qualcosa in comune e cioè che facilitano o promuovono la riproduzione di alcuni microrganismi. La differenza sta nella composizione di ciascuno di essi, fattore determinante per l'utilità finale che avranno.

Ciascuno dei mezzi di coltura esistenti è strategicamente progettato per la funzione specifica per la quale è stato creato, cioè tutti hanno una base che governa le linee guida della loro funzione specifica.

Si precisa che i terreni di coltura una volta seminati devono essere sottoposti a condizioni di temperatura e ossigeno adeguate al tipo di batterio o fungo da isolare.

Ad esempio, se si desidera isolare i batteri anaerobici mesofili, è possibile utilizzare agar sangue e incubare in condizioni anaerobiche (senza ossigeno) a 37 ° C per 48 ore.

Ora, se un fungo deve essere isolato, viene utilizzato l'agar Sabouraud con antibiotici. Viene incubato in aerobiosi, a temperatura ambiente per diversi giorni, poiché questi ultimi sono a crescita lenta.

Terreni di coltura semplici nutrienti

Come suggerisce il nome, questi terreni di coltura contengono sostanze nutritive, come fonti di vitamine, aminoacidi, azoto e carbonio, tra cui possiamo citare: estratto di carne o estratto di lievito, amido di mais, digestato pancreatico, peptoni, glucosio, tra gli altri.

Contengono anche altri componenti che forniscono all'ambiente un equilibrio osmotico, poiché la maggior parte delle colture richiede un pH vicino a 7.0. Questi elementi possono essere: cloruro di sodio, fosfato disodico, tra gli altri.

Il diluente è acqua distillata e i terreni solidi hanno agar-agar.

Lo scopo di questi terreni di coltura è recuperare il microbiota batterico o fungino presente in un dato campione. Non discrimina tra i microrganismi, poiché è in grado di far crescere un gran numero di batteri, sia Gram positivi che Gram negativi, nonché lieviti e funghi miceliali.

Sono consigliate per la semina di campioni da siti normalmente sterili. Tuttavia, non sono adatti per microrganismi esigenti.

Sono utili anche per il mantenimento dei ceppi, purché non contengano glucosio.

Terreni di coltura arricchiti

Se si aggiunge sangue o sangue riscaldato ai terreni nutritivi semplici, questi diventano terreni arricchiti (rispettivamente agar sangue e agar cioccolato).

Questi terreni sono molto utili per la semina di campioni normalmente sterili, per il salvataggio di ceppi deboli e per l'isolamento di microrganismi nutrizionalmente esigenti.

Terreni di coltura selettivi

Terreni di coltura selettivi oltre a contenere nutrienti essenziali per la crescita di alcuni microrganismi di interesse, vengono anche aggiunte sostanze inibitorie, come antibiotici, antimicotici, coloranti, sali biliari, tra gli altri.

Le sostanze inibitrici hanno lo scopo di ridurre la varietà di ceppi che possono crescere, favorendo la crescita di un gruppo particolarmente speciale che deve essere salvato.

Esempio: brodo CE (speciale per coliformi totali e fecali) o agar Sabouraud con antibiotici (specifico per funghi).

Terreni di coltura differenziale

I terreni differenziali contengono elementi nutritivi necessari per la crescita di uno specifico gruppo di microrganismi e contengono anche sostanze che in presenza di determinati microrganismi verranno metabolizzate o degradate.

Cioè, produrranno reazioni chimiche che in un modo o nell'altro saranno evidenziate nel mezzo di coltura.

Alcune reazioni alcalinizzano o acidificano il mezzo e, grazie alla presenza di un indicatore di pH, questi cambiamenti possono essere evidenziati attraverso uno spostamento di colore nel mezzo e nella colonia.

Pertanto, tra un ampio gruppo di batteri che potranno crescere in questo terreno, si distingueranno quelli che metabolizzano o degradano la sostanza e quelli che non lo fanno, semplicemente osservando il colore della colonia e del terreno.

Ad esempio, l'agar sangue consente di distinguere i batteri che causano la beta emolisi (alone chiaro) da quelli che causano alfa emolisi (alone verdastro) e quelli che non producono emolisi.

Mezzi selettivi e differenziali

Un esempio di ciò è ciò che accade nell'agar MacConkey. È selettivo poiché consente solo la crescita di bacilli Gram negativi; ed è differenziale, dal momento che i batteri fermentanti il ​​lattosio (colonie fucsia) possono essere distinti dai batteri non fermentanti (rosa pallido o incolori).

Mezzi di coltura per il trasporto

Come suggerisce il nome, sono mezzi utilizzati per trasportare campioni prelevati in un luogo più o meno distante al laboratorio che elaborerà il campione. Il mezzo di trasporto mantiene il campione nelle migliori condizioni in modo da ottenere risultati affidabili.

Questi terreni di coltura hanno caratteristiche molto particolari, poiché non possono essere superati in nutrienti, poiché la popolazione batterica presente è tenuta a rimanere vitale, ma senza aumentare di numero.

Sono generalmente mezzi semisolidi, che consentono al campione di rimanere idratato. Tuttavia, non si dovrebbe scendere a compromessi per portare il campione al laboratorio il prima possibile. Esempi di mezzi di trasporto: Stuart medium, Cary Blair e Amies.

Mezzi di coltura di arricchimento

Questi terreni di coltura sono liquidi. Sono utilizzati per salvare patogeni specifici che in un dato momento possono essere presenti in un campione in quantità minime.

È anche utile per salvare un ceppo patogeno che potrebbe essere debole da qualsiasi precedente trattamento ricevuto. Es: acqua peptone, brodo di tioglicolato e brodo di selenite.

Questi terreni hanno sostanze inibitorie che impediscono la crescita del microbiota di accompagnamento e nutrienti specifici che favoriscono lo sviluppo del microrganismo di interesse.

Terreni di coltura a scopo di identificazione

Questi mezzi contengono sostanze che possono essere metabolizzate chimicamente da alcuni batteri, producendo reazioni chimiche che mostrano la presenza di enzimi specifici o vie metaboliche.

Pertanto, vengono utilizzati come test biochimici che aiutano nel riconoscimento del genere e delle specie di un particolare gruppo di ceppi. Esempio: il mezzo Kligler mostra se il microrganismo è in grado di fermentare glucosio e lattosio, se produce idrogeno solforato e gas.

Questo mezzo contiene sostanze rivelatrici che consentono di osservare la reazione, come l'indicatore di pH e ioni di ferro.

Questo semplice test può differenziare due grandi gruppi di microrganismi batterici, come i batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae dai cosiddetti batteri non fermentanti.

Terreno per il conteggio delle colonie

Si tratta di terreni semplici e non selettivi che servono per la quantificazione di una popolazione microbica, come il terreno di conteggio standard. Il tipo di microrganismo che crescerà in questo terreno dipenderà dalla temperatura e dalle condizioni di ossigeno stabilite.

Terreni di coltura per test di sensibilità

Il terreno standardizzato per questo scopo è l'agar Müeller Hinton, questo terreno è ideale per valutare il comportamento di diversi antibiotici contro un microrganismo patogeno isolato.

È particolarmente utile nei batteri poco esigenti, mentre nei batteri esigenti può essere utilizzato solo se integrato con sangue.

Terreni di coltura per la manutenzione

Lo scopo di questi mezzi è quello di riprodurre il microrganismo e anche di mantenere la vitalità del batterio o del fungo il più a lungo possibile e anche di preservarne le funzioni fisiologiche.

Una caratteristica importante è che questo tipo di terreno non deve contenere glucosio, perché sebbene sia un elemento che fornisce una rapida crescita, la sua fermentazione produce anche acidi che diminuiscono la vita del microrganismo.

Alcuni laboratori devono mantenere alcuni microrganismi vitali per un uso successivo in studi di ricerca, controlli interni o per scopi educativi.

Preparazione

Attualmente ci sono molti marchi commerciali che distribuiscono i diversi mezzi di coltura. Il supporto è disponibile in forma liofilizzata o disidratata, contenuto in barattoli ermetici e protetto dalla luce.

Ogni mezzo viene fornito con un'etichetta che specifica il nome del mezzo, i suoi componenti, il numero di lotto e quanto pesare per preparare un litro di terreno di coltura.

L'acqua distillata viene utilizzata come diluente. La quantità pesata viene sciolta in un litro di acqua distillata fino ad omogeneizzazione della miscela. La maggior parte dei supporti sono autoclavati, a una pressione di 15 libbre, a una temperatura di 121 ° C, per 15 minuti.

I mezzi liquidi sono autoclavati già distribuiti nei rispettivi tubi di lavoro, mentre i mezzi solidi sono autoclavati in fiasche Erlenmeyer.

Questi ultimi vengono lasciati riposare fino a raggiungere la temperatura di 55 ° C e vengono serviti nelle piastre Petri all'interno di una cappa a flusso laminare o vicino al becco Bunsen. Si lasciano solidificare e si ripongono in frigorifero capovolti.

Esistono anche terreni di coltura solidi che vengono distribuiti in tubi, consentendo loro di solidificarsi in perni (dritti) o in becco di flauto (inclinato).

Prima di utilizzare qualsiasi mezzo di coltura preparato, solido o liquido, deve essere temperato prima della semina del campione.

Importanza

I terreni di coltura sono senza dubbio uno strumento di lavoro molto prezioso per i microbiologi, poiché consentono di recuperare l'agente infettivo che in un certo momento può colpire un individuo o contaminare un alimento, un ambiente o una superficie.

In questo senso, si può affermare che la microbiologia ha diversi campi, tra cui la microbiologia clinica, industriale, ambientale, alimentare, tra gli altri, e in tutti vengono utilizzati terreni di coltura.

Naturalmente, il tipo di mezzo utilizzato in ogni caso può variare in base alle esigenze e al tipo di campione processato. Il gruppo di microrganismo ha cercato anche influenze.

L'isolamento del microrganismo patogeno o la causa di qualsiasi contaminazione è essenziale per poter attuare un trattamento efficace o adottare procedure che aiutino ad eliminare il contaminante in questione.

Nel caso della microbiologia clinica, non solo è importante isolare il microrganismo e identificarlo (conoscere il genere e la specie), ma deve essere eseguito anche l'antibiogramma.

Questo studio, che utilizza anche un terreno di coltura, ci permetterà di dire quale antimicrobico è sensibile e quale è resistente, o in breve, quale può essere usato come trattamento e quale no.

Pertanto, i terreni di coltura in generale non possono mancare in un laboratorio di microbiologia, qualunque sia l'area.

Infine, si può affermare che i terreni di coltura hanno permesso di studiare vari aspetti sia dei batteri che dei funghi.

Controllo di qualità dei terreni di coltura

La preparazione e l'uso dei terreni di coltura non dovrebbero essere fatti alla leggera. In ogni laboratorio deve esserci un reparto che applica i protocolli di controllo della qualità ai terreni, ogni volta che vengono preparati nuovi lotti, e quindi assicurarsi che siano adeguatamente preparati, sterili e funzionali.

Per valutarne la sterilità, uno o due terreni vengono prelevati a caso da ciascun lotto e incubati a 37 ° C per diversi giorni (non dovrebbe esserci crescita). Per verificare la loro funzione vengono utilizzati ceppi di riferimento ATCC (American Type Culture Collection) debitamente coltivati ​​e vitali.

Smaltimento dei terreni di coltura

Dopo aver utilizzato il terreno di coltura, deve essere smaltito in modo tale da non contaminare l'ambiente.

Per questo, il materiale viene sterilizzato in autoclave prima di essere scartato. Successivamente, il materiale viene rimosso dalla vetreria. Quest'ultimo viene quindi lavato, asciugato, sterilizzato e conservato per un uso successivo. In caso di utilizzo di piastre monouso, queste vengono sterilizzate e successivamente smaltite in appositi sacchetti.

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