PUÒ MACCHIARE GRÜNWALD-GIEMSA: LOGICA, TECNICA E USI - BIOLOGIA - 2025

La colorazione di May Grünwald-Giemsa o Pappenheim è una tecnica di colorazione differenziale che miscela i reagenti Giemsa e May Grünwald. Viene utilizzato per la differenziazione di cellule del sangue normali e anormali in strisci di sangue periferico e midollo osseo, nonché per la colorazione di sezioni istologiche e campioni citologici.

Entrambi i reagenti -Giemsa e May Grünwald- derivano dalla colorazione di tipo Romanowsky, una tecnica che si basa sulla combinazione di coloranti acidi e basici.

Striscio che mostra un neutrofilo segmentato e un miglioocita in un caso di leucemia mieloide cronica, colorato con la colorazione di May Grünwald Giemsa. Dr Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) tramite Wikipedia.org.

Giemsa ha migliorato la tecnica stabilizzando la miscela di eosina, blu di metilene e loro derivati, con glicerolo. May Grünwald utilizza invece eosina e blu di metilene, utilizzando metanolo come solvente. Questa combinazione strategica ha dato ottimi risultati.

Sebbene in termini di osservazione della morfologia cellulare agisca in modo simile alle colorazioni di Giemsa e Wright, questa tecnica migliora le precedenti affinando la colorazione dei parassiti che causano malaria, malattia di Chagas, leishmaniosi e tricomoniasi.

Inoltre, si è dimostrata una tecnica molto utile per lo studio citologico del liquido spermatico. Si è distinto non solo mostrando le caratteristiche morfologiche dello sperma, ma anche consentendo la differenziazione di leucociti, cellule epiteliali e cellule di spermatogenesi con grande efficienza.

Base

La tecnica segue le fondamenta dei coloranti Romanowsky, in cui i coloranti acidi hanno affinità selettiva per i componenti cellulari di base e i componenti acidi attraggono le macchie di base.

Spiegato in altro modo, sia le strutture cellulari che i coloranti hanno cariche elettriche positive o negative; cariche simili si respingono e cariche diverse si attraggono.

Ad esempio, i coloranti di base come il blu di metilene sono caricati positivamente e sono attratti da strutture caricate negativamente. Ecco perché questo colorante colora i nuclei ricchi di DNA e RNA che hanno gruppi fosfato caricati negativamente.

Anche i granuli dei basofili segmentati e i citoplasmi dei globuli bianchi mononucleati contenenti RNA sono colorati.

Allo stesso modo, il colorante acido trasporta una carica negativa, motivo per cui si lega a strutture caricate positivamente come eritrociti e granuli di eosinofili segmentati. Per quanto riguarda i granuli di neutrofili segmentati, questi fissano entrambi i coloranti.

Varietà di coloranti

In questa tecnica coesiste una combinazione di reazioni tra coloranti ortocromatici e metacromatici. Gli ortocromatici (eosina e blu di metilene) si legano alla struttura cellulare a cui sono correlati e forniscono un colore stabile che non varia.

D'altra parte, le metacromatiche (i derivati ​​del blu di metilene azzurro A e azzurro B), variano il loro colore originale una volta attaccate alla struttura specifica, e possono esserci anche una varietà di sfumature.

Infine, il passaggio che la soluzione May Grünwald compie richiede la presenza di acqua, poiché senza di essa il colorante penetrerà nelle strutture ma non si fisserà. Perché ciò avvenga, il colorante deve diventare polare o ionizzare, e quindi essere in grado di precipitare e legarsi alle strutture correlate.

Tecnica

materiali

- Diapositive diapositive.

- Ponti di colorazione.

- Soluzione May-Grünwald.

- Macchia di Giemsa.

- Acqua distillata.

Può Grünwald colorante soluzione concentrata

Pesare 0,25 g di blu eosina-metilene (colorazione secondo May Grünwald) e scioglierli in 100 ml di metanolo. Quindi la preparazione viene miscelata per 1 ora e lasciata riposare per 24 ore. Alla fine del tempo, viene filtrato.

Per applicare la tecnica, il colorante May Grünwald deve essere diluito come segue: per 200 ml di colorante diluito, misurare 30 ml della soluzione concentrata, aggiungere 20 ml di soluzione tampone e 150 ml di acqua distillata regolata a pH7,2-7,3 . Successivamente viene miscelato e filtrato.

Colorante concentrato di Giemsa

Pesare 0,5 g di azzurro-eosina-blu di metilene (colorazione secondo Giemsa), sciolti in 50 ml di metanolo e 50 ml di glicerina aggiunti alla miscela.

Per eseguire la tecnica, diluire 1:10 con la soluzione tampone e lasciar riposare per 10 minuti. Può essere filtrato se necessario.

Preparazione della soluzione tampone a pH 7,2

Dovrebbero essere pesati:

- 40 mg di potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4).

- 151 mg di di-sodio idrogenofosfato 12-idrato (Na2HPO4).

Entrambi i composti vengono sciolti in 100 ml di acqua.

Procedura di colorazione dello striscio di sangue o midollo osseo

Ci sono due modalità: una classica e una veloce.

Modalità classica

1. Coprire gli strisci per 2 o 3 minuti con la soluzione diluita di May-Grünwald.
2. Lavare con acqua distillata tamponata per rimuovere la soluzione precedente.
3. Coprire con la stessa soluzione di lavaggio tamponata e lasciare agire per 1 minuto. L'idea è che il colorante precedente sia fissato alle strutture e che, allo stesso tempo, le cellule siano idratate.
4. Aggiungere 12 gocce di tintura Giemsa diluita all'acqua tamponata e soffiare per mescolare e omogeneizzare. Lascia riposare per 15-20 minuti.
5. Lavare gli strisci con acqua distillata tamponata e lasciarli asciugare all'aria.
6. Mettere a fuoco e visualizzare le cellule del sangue colorate al microscopio ottico utilizzando l'obiettivo 40X. Se necessario, è possibile utilizzare il 100X.

Modalità rapida

1. Coprire lo striscio con il colorante May Grünwald diluito per 1 minuto.
2. Lavare con acqua distillata tamponata.
3. Coprite con acqua tamponata e lasciate riposare per 1 minuto.
4. Aggiungere la macchia di Giemsa diluita e lasciare agire per 5 minuti.
5. Lavare con acqua distillata tamponata e lasciare asciugare all'aria.

Le tecniche qui descritte sono una linea guida, ma va tenuto presente che le procedure e i tempi di colorazione variano a seconda dell'azienda commerciale che distribuisce i reagenti. Si consiglia di seguire i passaggi strettamente indicati da ogni casa commerciale.

Tecnica per colorare strisci di liquido spermatico

1- Coprire lo striscio con uno strato sottile della soluzione di May Grünwald per 4 minuti.

2- Rimuovere il colorante e lavare con acqua distillata.

3- Porre uno strato di Giemsa diluito (1:10) in acqua distillata per 15 minuti.

4- Rimuovere il colorante e lavare con acqua distillata.

5- Lasciar asciugare e osservare al microscopio.

Colori attesi con la tinta May Grünwald Giemsa

Specifiche importanti

La tecnica richiede che i reagenti e le soluzioni di lavaggio abbiano un pH regolato a 7.2 -7.3, in modo che le affinità dei coloranti per le strutture cellulari non vengano distorte e il colore finale previsto non vari.

applicazioni

Questa tecnica viene utilizzata dai laboratori clinici per colorare strisci di sangue periferico e midollo osseo, sezioni di tessuto e citologie.

In campo ematologico, questa tecnica è di vitale importanza nello studio delle anomalie delle cellule in termini di forma, dimensione e numero. È uno strumento molto prezioso per la diagnosi di alcune malattie, come la leucemia e l'anemia.

Inoltre, è di eccezionale utilità nella ricerca di parassiti nelle aree ematologiche (Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi) o istologiche (Leishmania sp).

Citologia vaginale

Per quanto riguarda la citologia vaginale, questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per l'osservazione del Trichomonas vaginalis. Questa è una scoperta importante, poiché la sua presenza simula immagini di carcinoma in situ che poi scompaiono quando il parassita viene eliminato.

Campione di sperma

È stato uno strumento ideale per lo studio dei campioni di sperma, poiché fornisce preziose informazioni sulla qualità dello sperma.

I dati che offre hanno a che fare principalmente con il numero e la morfologia, nonché con le cellule concomitanti che possono essere presenti e che sono di vitale importanza, come le cellule germinali, leucociti e le cellule epiteliali.

Con questa analisi è possibile descrivere le anomalie osservate nello sperma nella testa, nel collo, nella parte centrale e nel pezzo principale.

Inoltre, possono anche aiutare a mostrare casi di emospermia (presenza di globuli rossi nello sperma) e leucospermia o piospermia (aumento del numero di leucociti nello sperma).

Riferimenti

1. Costamagna S, Prado M. Validazione del test fresco, colorazioni May Grünwald-Giemsa e Gram e terreni di coltura per la diagnosi di Trichomonas vaginalis. Parassitolo. 2001; 25 (1-2): 60-64. Disponibile in: scielo.
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