COLORAZIONE KINYOUN: LOGICA E TECNICHE - BIOLOGIA - 2025

La colorazione Kinyoun è una tecnica di colorazione utilizzata per colorare batteri e parassiti resistenti all'alcool acido. Nasce dalla modifica della colorazione Ziehl-Neelsen; Entrambe le tecniche sono interpretate allo stesso modo ma differiscono per due elementi: nella preparazione del reagente principale e in quanto la tecnica Kinyoun non utilizza il calore.

Per questo motivo è anche noto come Ziehl-Neelsen modificato a freddo o macchia fredda Kinyoun. È indicato per la colorazione di Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, micobatteri atipici, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris e Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum colorato con colorante Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, da Wikimedia Commons

Vale la pena notare che i Nocardia si colorano debolmente con questa tecnica poiché sono parzialmente resistenti all'alcool acido, quindi per questo genere c'è una modifica della metodologia.

A sua volta, la tecnica Kinyoun a freddo è stata combinata con la tecnica tricromica modificata da Didier per la rilevazione di coccidi (Cryptosporidium parvum e Isospora belli) e spore di microsporidium (Enterocytozoon bieneusi ed Encephalitozoon intestinalis).

Base

Il principale reagente di colorazione è la carbolfucsina o carbol fuchsin, che ha la proprietà di legarsi agli acidi fenici all'interno della parete cellulare cerosa ricca di lipidi (acidi micolici) dei micobatteri e di alcuni parassiti.

Questo legame non viene contrastato dalla candeggina acida; pertanto, i microrganismi sono definiti acido-resistenti.

A differenza della tecnica Ziehl-Neelsen -che fissa il colorante attraverso il calore-, nella tecnica Kinyoun questo passaggio non è necessario, poiché la soluzione di fucsina fenica preparata per questa tecnica contiene un'alta concentrazione di fenolo.

Il fenolo dissolve il materiale lipidico nella parete cellulare, permettendo al colorante carbolfuchsina di entrare. Dopo che il colorante è penetrato, rimane fisso nonostante il lavaggio con alcol acido.

In questo modo i microrganismi acido resistenti assumono il caratteristico colore rosso, mentre tutto ciò che non è acido resistente si scolorisce e si colora di blu.

Tecnica

materiali

- Carbol fuchsin modificato.

- Alcol-acido.

- Blu di metilene.

Preparazione di Kinyoun carbol fuchsin

- Fucsina base: 4 gr.

- Fenolo: 8 ml.

- Alcol (95%): 20 ml.

- Acqua distillata: 100 ml.

La fuchsina di base va sciolta lentamente nell'alcool, mescolando continuamente. Successivamente, il fenolo cristallizzato viene sciolto a bagnomaria a 56 ° C. Una volta sciolto, si aggiungono 8 ml alla soluzione di fucsina preparata sopra.

Preparazione dell'acido alcolico

- Acido cloridrico concentrato: 3 ml.

- Etanolo (95%): 97 ml.

Deve essere misurato, unito e miscelato.

Preparazione del colorante di contrasto blu di metilene

- Blu di metilene: 0,3 g.

- Acqua distillata: 100 ml.

Viene pesato e sciolto.

Tecnica di colorazione Kinyoun

1- Preparare uno striscio direttamente dal campione, che può essere espettorato, liquido polmonare, sedimento urinario, liquido cerebrospinale o feci, tra gli altri; o da una sospensione di microrganismi ottenuta da colonie pure sviluppate in terreni di coltura primari.

2- Fissare lo striscio con il calore.

3- Posizionare lo striscio sul ponte di colorazione e coprire con il reagente Kinyoun carbol fuchsin preparato. Lascia riposare per 3-5 minuti.

4- Lavare con acqua distillata.

5- Candeggiare con alcool acido per 3 minuti e lavare nuovamente con acqua distillata.

6- Candeggiare di nuovo con alcool acido per 1 o 2 minuti fino a quando non viene più eliminata la colorazione.

7- Lavare con acqua distillata e lasciar sgocciolare, ponendo il vetrino in posizione verticale.

8- Coprire la preparazione con blu di metilene e lasciare agire 4 minuti.

9- Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare all'aria.

10- Esamina a 40X e poi a 100X.

Per migliorare e accelerare la colorazione dei microrganismi acido resistenti, aggiungere 1 goccia di un agente umettante (come il tergitolo n. 7) a 30 o 40 ml di Kinyoun Carbol Fuchsin.

Alcuni laboratori cambiano il colorante di contrasto blu di metilene in verde brillante o acido picrico; il primo dà un colore verde allo sfondo e il secondo genera un colore giallo.

Tecnica Kinyoun speciale per Nocardie

Per migliorare la colorazione dei batteri del genere Nocardia viene utilizzata una modifica della colorazione Kinyoun. La tecnica è la seguente:

1- Copri lo striscio con Kinyoun carbol fuchsin per 3 minuti.

2- Lavare con acqua distillata.

3- Scolorire brevemente con alcool acido preparato al 3% fino a scomparsa della colorazione.

4- Lavare di nuovo con acqua distillata.

5- Coprite la preparazione con blu di metilene e lasciate agire per 30 secondi.

6- Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare all'aria.

Tecnica combinata di carbol fuchsin e tricromia modificata da Didier

Questa tecnica è consigliata per l'analisi simultanea di campioni di feci per spore di coccidi e microsporidi. La procedura da seguire è la seguente:

1- Coprire lo striscio con Kinyoun carbol fuchsin per 10 minuti.

2- Rimuovere il colorante e lavare con acqua distillata.

3- Candeggina per 30 secondi con alcol acido cloridrico.

4- Lavare di nuovo con acqua distillata.

5- Coprire lo striscio con soluzione tricromica per 30 minuti a 37 ° C.

6- Lavare con acqua distillata.

7- Candeggina per 10 secondi con alcol acido acetico.

8- Lavare lo striscio per 30 secondi utilizzando etanolo al 95%.

QA

Come controllo positivo, gli strisci con i ceppi di Mycobacterium tuberculosis vengono preparati e colorati con i reagenti preparati per verificare che i batteri assumano il colore appropriato (rosso-fucsia).

I controlli negativi possono essere utilizzati anche preparando strisci con qualsiasi ceppo diverso dall'alcool acido rapido, verificando così che l'intero campione assuma il colore contrastante.

Tecnica Kinyoun rispetto alla tecnica Ziehl-Neelsen

La tecnica Kinyoun è più semplice in quanto elimina la fase di riscaldamento, ma il suo principale vantaggio è quello di evitare l'emissione di vapori, altamente tossici e cancerogeni a lungo termine. Pertanto, la macchia Kinyoun è più sicura per il personale addetto alla colorazione.

È importante tenere presente che è necessario prestare attenzione che i reagenti non vengano a contatto diretto con la pelle, poiché sono corrosivi e la candeggina è infiammabile.

Per quanto riguarda gli svantaggi, uno striscio negativo non indica necessariamente che l'organismo non è presente. Inoltre, la presenza di detriti cellulari può portare a falsi positivi, portando a confusione nella diagnosi.

Riferimento

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