MACCHIA DI GIEMSA: LOGICA, MATERIALI, TECNICA E USI - BIOLOGIA - 2025

Il colorante Giemsa è un tipo di campioni clinici coloranti, basato sulla miscela di coloranti acidi e basici. La sua creazione è stata ispirata dal lavoro svolto da Romanowsky, dove Gustav Giemsa, chimico e batteriologo originario della Germania, lo perfezionò aggiungendo glicerolo per stabilizzare i composti.

Le modifiche generate alla tecnica originaria di Romanowsky hanno permesso di migliorare notevolmente le osservazioni microscopiche, pertanto la tecnica è stata battezzata con il nome di Giemsa stain.

Vari campioni colorati con colorante Giemsa. A. Trypanosoma evansi nel sangue periferico. B. Globuli normali. C. Borrelia theileri nel sangue periferico. Linfoma di D. Burkitt.

Poiché è una tecnica semplice da eseguire, altamente funzionale ed economica, è attualmente ampiamente utilizzata nel laboratorio clinico per strisci ematologici, campioni di midollo osseo e sezioni di tessuto.

La tecnica di colorazione Giemsa è molto utile per gli studi citologici, in quanto consente l'osservazione di specifiche strutture cellulari. Questa tecnica colora i citoplasma, i nuclei, i nucleoli, i vacuoli ei granuli delle cellule, riuscendo a distinguere anche tracce fini di cromatina.

Inoltre, possono essere rilevati cambiamenti significativi nella dimensione, forma o colorazione del nucleo, dove è possibile visualizzare la perdita della relazione nucleo-citoplasma.

D'altra parte, consente di identificare le cellule immature nel midollo osseo e nel sangue periferico, essendo importante per la diagnosi di malattie gravi come la leucemia. È anche possibile rilevare emoparassiti, batteri extra e intracellulari, funghi, tra gli altri.

Nella citogenetica è ampiamente utilizzato, poiché è possibile studiare la mitosi delle cellule.

Base della colorazione di Giemsa

I coloranti di tipo Romanowsky si basano sull'utilizzo di un contrasto tra coloranti acidi e basici, per ottenere la colorazione rispettivamente delle strutture basiche e acide. Come si può vedere, c'è un'affinità dei coloranti acidi per colorare le strutture di base e viceversa.

Il colorante di base utilizzato è il blu di metilene e suoi derivati ​​ossidati (Azure A e Azure B), mentre il colorante acido è l'eosina.

Le strutture acide delle cellule sono gli acidi nucleici, i granuli dei basofili segmentati, tra gli altri, quindi saranno colorati con blu di metilene.

In questo stesso senso, le strutture di base delle cellule sono l'emoglobina e alcuni granuli come quelli contenuti negli eosinofili segmentati, tra gli altri; questi saranno colorati con eosina.

D'altra parte, poiché il blu di metilene e l'azzurro si caratterizzano per essere coloranti metacromatici, possono fornire una tonalità variabile alle diverse strutture a seconda del carico di polianioni che possiedono.

È così che la combinazione strategica di coloranti basici e acidi riesce a sviluppare un ampio spettro di colori, in base alle caratteristiche biochimiche di ciascuna struttura, percorrendo sfumature celesti, blu scuro, lilla e viola nel caso di strutture acide.

Mentre la colorazione fornita dall'eosina è più stabile, generando colori tra arancio rossastro e salmone.

materiali

Materiali per preparare la soluzione madre

La preparazione della soluzione madre richiede la pesatura di 600 mg di colorante Giemsa in polvere, la misurazione di 500 cc di alcol metilico senza acetone e 50 cc di glicerina neutra.

Come preparare la soluzione madre

Metti la polvere di Giemsa pesante in un mortaio. Se ci sono grumi dovrebbero essere spruzzati. Successivamente aggiungere una quantità apprezzabile della glicerina misurata e mescolare molto bene. La miscela ottenuta viene versata in una bottiglia ambrata molto pulita.

Il resto della glicerina viene posto nel mortaio. Mescolare ancora per pulire il resto del colorante che ha aderito alle pareti della malta e versare nello stesso barattolo.

La bottiglia viene tappata e posta a bagnomaria a 55 ° C per 2 ore. Mentre è a bagnomaria, agita delicatamente la miscela ogni mezz'ora circa.

Successivamente, la miscela viene lasciata raffreddare per porre l'alcol. In precedenza, una parte dell'alcool misurato viene posta nella malta per terminare il lavaggio del colorante rimanente e poi viene aggiunta alla miscela insieme al resto dell'alcool.

Questa preparazione dovrebbe essere lasciata maturare per almeno 2 settimane. La parte utilizzata della soluzione madre deve essere filtrata.

Per evitare la contaminazione del preparato, si consiglia di trasferire la porzione che verrà utilizzata costantemente in un flacone ambrato con un contagocce. Riempire ogni volta che il reagente si esaurisce.

Materiali per preparare la soluzione tampone

D'altra parte, una soluzione tampone a pH 7,2 viene preparata come segue:

Si pesano fino a 1000 cc 6,77 g di sodio fosfato (anidro) (NaHPO ₄ ), 2,59 g di potassio diidrogenofosfato (KH ₂ PO ₄ ) e acqua distillata.

Preparazione finale del colorante

Per la preparazione della soluzione colorante finale, vengono misurati 2 ml della soluzione madre filtrata e miscelati con 6 ml della soluzione tampone. Mescola la miscela.

Un fatto rilevante che deve essere preso in considerazione è che le tecniche di preparazione del colorante possono cambiare a seconda dell'azienda commerciale.

Materiali aggiuntivi necessari per eseguire la colorazione

Oltre ai materiali descritti, è necessario disporre di ponti per colorare, magliette con acqua o tampone per il lavaggio, vetrini o coperture per oggetti, un cronometro per controllare i tempi di colorazione e carta assorbente o del materiale che può essere utilizzato per asciugare ( garza o cotone).

Tecnica

Processo di colorazione

1) Prima della colorazione, lo striscio del campione deve essere pronto su un vetrino pulito.

I campioni possono essere sangue, midollo osseo, sezioni di tessuto istologico o campioni cervico-vaginali. Si raccomanda che le creme da spalmare siano sottili e abbiano 1 o 2 ore di asciugatura prima della colorazione.

2) Su un ponte da colorare, posizionare tutti i fogli che devono essere colorati. Lavori sempre nello stesso ordine e ogni foglio è ben identificato.

3) Porre sullo striscio alcune gocce di alcool metilico al 100% (metanolo) e lasciarlo agire da 3 a 5 minuti, in modo da fissare e disidratare il campione.

4) Gettare il metanolo presente sulla lastra e lasciare asciugare all'aria.

5) Una volta asciutto, posizionare la soluzione colorante finale con un contagocce fino a coprire l'intero foglio. Lasciate agire 15 minuti. Alcuni autori consigliano fino a 25 min. Dipende dalla casa d'affari.

6) Scolare la macchia e lavare lo striscio con acqua distillata o con una soluzione tampone 7.2.

7) Su carta assorbente lasciare asciugare i fogli all'aria, disposti verticalmente con l'aiuto di un supporto.

8) Pulire il retro del vetrino con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol o un batuffolo di cotone per rimuovere ogni traccia di macchia.

Utilità

La tecnica di colorazione Giemsa viene utilizzata in vari settori, tra cui: ematologia, micologia, batteriologia, parassitologia, citologia e citogenetica.

Ematologia

È l'uso più frequente dato a questa macchia. Con esso, è possibile identificare ciascuna delle cellule presenti nel midollo osseo o nei campioni di sangue periferico. Oltre a stimare il numero di ciascuna serie, essere in grado di rilevare leucocitosi o leucopenia, trombocitopenia, ecc.

Poiché è sensibile nell'identificazione delle cellule immature, è rilevante nella diagnosi delle leucemie acute o croniche. È anche possibile fare la diagnosi di anemia, come anemia falciforme, anemia falciforme, tra gli altri.

Micologia

In quest'area, il suo utilizzo è comune per la ricerca di Histoplasma capsulatum (fungo dimorfico intracellulare) in campioni di tessuto.

Batteriologia

Negli strisci ematologici colorati con Giemsa è possibile rilevare Borrelias sp in pazienti che presentano la malattia chiamata febbre ricorrente. Le spirochete sono abbondanti tra gli eritrociti, in campioni prelevati al culmine della febbre.

È anche possibile visualizzare batteri intracellulari come Rickettsia sp e Chlamydia trachomatis nelle cellule infette.

parassitologia

Nel campo della parassitologia, la colorazione di Giemsa ha permesso di diagnosticare malattie parassitarie come malaria, malattia di Chagas e leishmaniosi.

Nei primi due si possono osservare rispettivamente i parassiti Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi nel sangue periferico dei pazienti infetti, si possono riscontrare in stadi diversi a seconda della fase in cui si trova la malattia.

Per migliorare la ricerca di parassiti nel sangue, si consiglia di utilizzare il colorante Giemsa miscelato con il colorante May-Grünwald.

Allo stesso modo, la leishmaniosi cutanea può essere diagnosticata valutando campioni bioptici cutanei macchiati di Giemsa in cui si trova il parassita.

Citologia

La colorazione di Giemsa viene utilizzata anche per lo studio citologico di campioni endocervicali, sebbene non sia la tecnica più frequentemente utilizzata a questo scopo.

Ma in caso di scarsità di risorse può essere utilizzato, avendo una funzionalità simile a quella offerta dalla tecnica Papanicolaou e ad un costo inferiore. Tuttavia, richiede esperienza da parte dell'esaminatore.

Citogenetica

Una caratteristica rilevante della colorazione di Giemsa è la sua capacità di legarsi fortemente alle regioni di DNA ricche di adenina e timina. Ciò consente di visualizzare il DNA durante la mitosi cellulare, in diversi stati di condensazione.

Questi studi sono necessari per rilevare le aberrazioni cromatiche come duplicazioni, delezioni o traslocazioni delle diverse regioni dei cromosomi.

Ricerche che dimostrano l'efficacia della colorazione Giemsa

Cannova et al (2016), hanno confrontato 3 tecniche di colorazione per la diagnosi della leishmaniosi cutanea.

Per questo, hanno utilizzato campioni ottenuti da un animale sperimentale (Mesocrisetus auratus) inoculato sperimentalmente con Leishmania.

Gli autori hanno dimostrato che la macchia di Giemsa era migliore della macchia di Pap-mart® e di Gaffney. Pertanto, hanno considerato la colorazione di Giemsa l'ideale per diagnosticare la leishmaniosi cutanea.

Gli ottimi risultati ottenuti dagli autori sono dovuti al fatto che la combinazione di coloranti che compongono la miscela Giemsa presenta le condizioni necessarie per creare un contrasto favorevole, consentendo di distinguere nettamente le strutture degli amastigoti, sia intracellulari che extracellulari.

Anche le altre tecniche (Pap-mart® e Gaffney) lo hanno fatto, ma in modo più debole e quindi più difficile da visualizzare. Ecco perché la colorazione Giemsa è consigliata per la diagnosi parassitologica della leishmaniosi.

Allo stesso modo, uno studio di Ramírez et al (1994) ha valutato la validità delle colorazioni di Giemsa e Lendrum negli strisci congiuntivali per l'identificazione della Chlamydia trachomatis.

Gli autori hanno stabilito che le macchie di Giemsa e Ledrum hanno la stessa specificità, ma Giemsa è risultata più sensibile.

Questo spiega perché la colorazione di Giemsa è attualmente la più utilizzata per la diagnosi delle infezioni da clamidia, soprattutto se le risorse sono poche.

Fonte: PanReac Applichem ITW Reagents. Macchia di Giemsa. Versione 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spagna.

Raccomandazioni per una buona colorazione

L'asciugatura dei fogli non deve essere accelerata. È necessario prevedere un tempo ragionevole per asciugarlo all'aria aperta. Circa 2 ore.

Colorare immediatamente dopo 2 ore per ottenere i migliori risultati.

Affinché gli strisci si fissino e si colorino meglio, il campione deve essere distribuito sul vetrino in modo che rimanga uno strato sottile e uniforme.

Il campione di sangue preferito è quello capillare, poiché lo striscio è realizzato direttamente dalla goccia di sangue e quindi il campione non contiene additivi, il che favorisce il mantenimento delle strutture cellulari.

Tuttavia, se viene utilizzato sangue venoso, l'EDTA dovrebbe essere usato come anticoagulante e non eparina, poiché l'eparina di solito deforma le cellule.

Errori comuni nella colorazione di Giemsa

Nella pratica di questa colorazione si possono commettere errori. Sono evidenziati da repentini cambiamenti nelle tonalità delle strutture.

Colorazione estremamente blu

Potrebbe essere dovuto a:

• Macchie molto spesse
• Superamento del tempo di colorazione
• Lavare in modo insufficiente.
• Uso di reagenti ben al di sopra del pH neutro (alcalino).

In queste condizioni i colori delle seguenti strutture sono distorti, in modo tale che gli eritrociti invece di tingersi di rosa salmone appariranno verdi, i granuli degli eosinofili che devono essere colorati di rosso mattone diventeranno bluastri o grigi e così via ci sarà deviazione nei soliti toni.

Colorazione eccessivamente rosa

Potrebbe essere dovuto a:

• Tempo di colorazione insufficiente.
• Lavaggio prolungato o eccessivo.
• Cattiva essiccazione.
• Uso di reagenti altamente acidi.

In questo caso particolare, le strutture che normalmente si colorano di blu non saranno quasi visibili, mentre le strutture che si colorano di rosa avranno tonalità notevolmente esagerate.

Esempio: i globuli rossi diventeranno rosso vivo o arancione brillante, la cromatina nucleare apparirà rosa pallido e i granuli di eosinofili si coloreranno di un rosso intenso e brillante.

Presenza di precipitati nello striscio

Le cause possono essere:

• Utilizzare pellicole sporche o poco lavate.
• Non lasciare asciugare bene lo striscio.
• Lasciando la soluzione di fissaggio troppo a lungo.
• Lavaggio inadeguato alla fine della colorazione.
• Filtrazione inadeguata o nessuna filtrazione del colorante utilizzato.

Presenza di artefatti morfologici

Gli artefatti morfologici possono apparire nelle macchie, rendendo difficile la visualizzazione e l'interpretazione delle strutture presenti. Questo è dovuto a:

• Tipo di anticoagulante utilizzato, come l'eparina.
• Utilizzo di pellicole sporche, deteriorate o unte.

Modalità di archiviazione

Dopo la preparazione, il colorante deve essere mantenuto a temperatura ambiente (15 - 25 ° C), per evitare che il colorante precipiti. Deve essere conservato in un contenitore ambra ben chiuso.

Riferimenti

1. Cannova D, Brito E e Simons M. Valutazione delle tecniche di colorazione per la diagnosi della Leishmaniosi cutanea. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW Reagents. Macchia di Giemsa. Versione 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spagna.
3. Clark G. Staining procedure (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Chimica clinica applicata. Colorazione di Giemsa per la diagnostica in vitro. Distributore: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F e Grazioso C. Validità delle macchie di Giemsa e Lendrum negli strisci congiuntivali per l'identificazione di Chlamydia trachomatis. Bol di Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Micologia generale. 1994. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
7. "Macchia di Giemsa." Wikipedia, l'enciclopedia libera. 1 settembre 2017, 01:02 UTC. 6 dicembre 2018, es.wikipedia.org.