COLORAZIONE DELLE CAPSULE: RAZIONALE E TECNICHE - BIOLOGIA - 2025

La capsula di colorazione è una tecnica di colorazione differenziale che ha la proprietà della struttura polisaccaridica da stress che circonda alcuni batteri e lieviti chiamati capsule. Viene utilizzato nei laboratori clinici per aiutare a diagnosticare alcune patologie causate da microrganismi capsulati.

Viene anche utilizzato nei laboratori didattici per la dimostrazione di questa struttura morfologica agli studenti delle carriere delle scienze della salute, come: medicina, bioanalisi, infermieristica o citotecnologia, tra gli altri.

Striscio di Klebsiella pneumoniae colorato con colorante per capsule. Metodo dell'inchiostro indiano con safranina. Fonte: А.А.В

Esistono diverse semplici tecniche per dimostrare la presenza della capsula nei microrganismi che la possiedono, queste sono: la macchia negativa, la macchia di Anthony e una variante che unisce le due precedenti.

La colorazione negativa viene utilizzata principalmente nei campioni di CSF quando si sospetta la presenza del lievito Cryptococcus neoformans. Questo lievito è una causa comune di meningite.

Questa tecnica utilizza nigrosina o inchiostro di china e si basa sulla creazione di un contrasto tra lo sfondo del preparato e la capsula impenetrabile del microrganismo. Lo sfondo diventa scuro e la capsula è incolore. In questo modo, questa struttura si rivela.

Per quanto riguarda la tecnica Anthony, si può affermare che viene utilizzata principalmente nei laboratori didattici per dimostrare la struttura dei polisaccaridi in batteri come Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis.

L'uso di questa tecnica a scopo diagnostico è molto raro, poiché esistono altri test di routine che consentono l'identificazione di questi microrganismi.

Base

La capsula è una struttura forte di natura polisaccaridica. Questo protegge i microrganismi dalla fagocitosi e quindi è una struttura difficile da penetrare.

Ecco perché le macchie delle capsule si basano sul contrasto. I coloranti macchiano il fondo della preparazione mentre la capsula rimane incolore.

Pertanto, con queste tecniche la capsula è facilmente riconoscibile. Se il microrganismo non ha una capsula, non sarà distinguibile con questo tipo di colorazione, perché tutto sarà macchiato dello stesso colore.

Tutte le tecniche utilizzate per colorare la capsula hanno la stessa logica nonostante l'utilizzo di coloranti e procedure differenti.

Tecniche par

- Macchia di Anthony

La macchia di Anthony usa il violetto di cristallo come macchia. Questo maccherà il corpo batterico e lo sfondo viola.

D'altra parte, viene utilizzato il 20% di solfato di rame. Serve come soluzione di lavaggio, cioè rimuove il cristallo viola in eccesso dal preparato, rendendo le capsule limpide ma senza che il corpo batterico o lo sfondo perdano colore.

materiali

- Latte iridescente.

- Diapositiva.

- 1% cristallo viola.

- 20% di solfato di rame.

- Microscopio ottico.

- Olio da immersione.

Processi

Questa tecnica consiste in:

1. Coltivare il microrganismo in latte iridescente per 36 ore.
2. Posizionare una goccia della coltura all'estremità di un vetrino e accanto ad essa, posizionare una goccia di vetro viola, mescolare e distribuire con l'estremità di un altro vetrino.
3. Asciugare all'aria e non riscaldare.
4. Lavare con una soluzione di solfato di rame al 20%, lasciare asciugare all'aria.
5. Osservare al microscopio con obiettivo a immersione. Cerca verso le estremità dello spread.

È importante non usare il calore né per fissare né per asciugare, poiché ciò danneggia la capsula. Inoltre non lavare con acqua.

Interpretazione

Il latte iridescente è un eccellente terreno di coltura in quanto fornisce i nutrienti necessari al microrganismo per sviluppare una capsula prominente.

D'altra parte, il latte iridescente formerà un fondo spesso e compatto che si colorerà di viola insieme al corpo batterico, ma la capsula che circonda il microrganismo rimarrà incolore. Pertanto, si osserva un alone chiaro attorno al corpo batterico.

Rappresentazione grafica sull'osservazione microscopica di uno striscio di Klebsiella pneumoniae colorato con il colorante di Anthony. Fonte: realizzato dall'autore MSc. Marielsa Gil.

Vantaggio

È una tecnica semplice da eseguire. Non necessita di fissaggio.

Inoltre, va notato che possono essere usati altri terreni di coltura, ma il mezzo a base di latte è preferito perché ha il vantaggio di fornire capsule più prominenti.

svantaggi

È una tecnica leggermente più laboriosa rispetto alla colorazione negativa e la sua visualizzazione richiede l'attesa che la preparazione si asciughi completamente.

-Colorazione negativa

materiali

- Diapositive diapositive.

- Terreno di coltura con il microrganismo.

- Inchiostro cinese o nigrosina.

- Microscopio ottico.

- Soluzione fisiologica salina.

Processi

Posizionare una goccia di soluzione salina fisiologica sul vetrino e sciogliere una piccola parte della coltura microbica. È importante che la preparazione non sia troppo densa. Quindi posizionare una goccia di inchiostro cinese o nigrosina e mescolare.

Un foglio di coprioggetto viene quindi posizionato sulla preparazione senza traboccare il liquido. Si osserva al microscopio concentrandosi prima su un obiettivo 10X e poi spostandosi su 40X.

Questa tecnica può essere utilizzata anche direttamente sui campioni di CSF. Cioè, invece di mettere una goccia di coltura microbica, viene posta una goccia di CSF.

Vantaggio

È un metodo semplice da eseguire e allo stesso tempo poco costoso. Non necessita di fissaggio o asciugatura del preparato.

svantaggi

Lo svantaggio è che deve essere osservato al microscopio prima che il preparato si asciughi, poiché se ciò accade i microrganismi si contrarranno, il che renderà difficile la visualizzazione.

D'altra parte, possono verificarsi falsi positivi se l'analista è inesperto, poiché i leucociti vengono spesso confusi con i lieviti.

L'osservazione di capsule di lievito con la tecnica dell'inchiostro cinese o della nigrosina deve essere considerata come una diagnosi presuntiva di Cryptococcus neoformans fino a quando non viene dimostrata con la coltura.

Questo perché esistono altri lieviti che potrebbero essere la causa della meningite e non solo Cryptococcus neoformans, come quelli del genere Candida e Rhodotorula, oltre ad altre specie di Cryptococcus.

Interpretazione

Se sono presenti microrganismi capsulati si osserverà uno sfondo scuro, con corpi trasparenti che galleggiano nel liquido, evidenziando la presenza della capsula.

Capsula di Cryptococcus neoformans colorata con inchiostro cinese. Fonte: Crediti fotografici: Fornitori di contenuti: CDC / Dr. Leanor haley

-Tecnica inchiostro indiano

Questa tecnica può essere eseguita anche con la nigrosina. È una combinazione delle tecniche precedentemente spiegate. Questa tecnica utilizza violetta cristallina e inchiostro indiano o nigrosina.

Il corpo batterico diventa viola dal violetto cristallino perché è caricato negativamente, mentre la nigrosina colora il fondo dello striscio. Se il batterio ha una capsula, apparirà come un alone trasparente attorno al microrganismo.

Il violetto cristallino può essere sostituito da uno qualsiasi di questi colori: safranina, fucsina basica o blu di metilene.

materiali

- Vetro viola.

- Nigrosina o inchiostro di china.

- Diapositive diapositive.

- Microscopio.

Processi

- Coltivare il microrganismo in un mezzo di coltura.

- Posizionare una goccia della coltura all'estremità di un vetrino e accanto ad essa, posizionare una goccia di inchiostro di china cristallino o nigrosina, mescolare e distribuire con l'estremità di un altro vetrino.

- Asciugare all'aria e non fissare al calore.

- Coprire con una soluzione di cristalli viola per 1 minuto, lavare con acqua distillata ma molto delicatamente (getto morbido), lasciare asciugare all'aria.

- Osservare al microscopio con un obiettivo da immersione. Cerca verso le estremità dello spread.

Interpretazione

Si vedrà un corpo batterico viola e uno sfondo scuro. La capsula, se presente, apparirà incolore intorno ai batteri.

Riferimenti

1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Tecniche di base di microbiologia. Osservazione dei batteri. Reduca (Biologia). Serie di microbiologia. 2010; 3 (5): 15-38. D
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3. Gil M. Colorazione negativa: razionale, tecnica, vantaggi e svantaggi. Lifeder.com.
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