TEST DI VOGES-PROSKAUER: FONDAZIONE, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2025

Il test Voges-Proskauer è un test biochimico utilizzato per aiutare l'identificazione dei batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. È particolarmente utile per differenziare i ceppi di Escherichia coli da Klebsiella ed Enterobacter, tra gli altri.

Il test viene eseguito in un terreno di coltura liquido denominato Methyl Red - Voges Proskauer, meglio conosciuto con l'acronimo RM / VP. Questo terreno è composto da polipeptone tamponato, glucosio, fosfato dipotassico e acqua distillata.

Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) mezzo commerciale / test VP rispettivamente positivo e negativo. Fonte: foto scattata dall'autore MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, da Wikimedia Commons

L'attuale terreno RM / VP è una modifica del terreno Clark e Lubs, che originariamente conteneva una concentrazione inferiore di peptoni e glucosio. Così, è stato prodotto meno ione idrogeno, necessario per la reazione positiva di Voges-Proskauer.

Il test si basa sulla capacità del microrganismo di utilizzare il glucosio attraverso la via butilenglicole e formare un prodotto finale neutro chiamato acetoina, in presenza di ossigeno e pH alcalino.

Nel mezzo RM / VP, oltre a poter rivelare il test di Voges-Proskauer, può essere rivelato anche il test del rosso metile.

Base

Base di prova di Voges-Proskauer

I pluripeptoni presenti nel terreno forniscono i requisiti nutrizionali essenziali per la crescita batterica. Da parte sua, il glucosio è il composto principale. Molti batteri hanno la capacità di metabolizzare il glucosio e formare acido piruvico.

L'acido piruvico è un punto intermedio nel metabolismo del glucosio e da lì ogni microrganismo può prendere strade diverse. Alcuni formeranno acidi misti, come acido lattico, acido acetico, acido formico e acido succinico, e altri formeranno prodotti neutri come il 2,3-butandiolo.

Il test di Voges-Proskauer rivela la capacità del microrganismo di formare acetil metil carbinolo (acetoina), un prodotto intermedio del 2,3-butandiolo in condizioni aerobiche.

L'acetoina è ridotta e forma 2,3-butandiolo, ma questa reazione è reversibile, quindi se il 2,3-butandiolo viene ossidato, si forma acetoina. Pertanto, l'ossigeno è essenziale.

Il fosfato dipotassico è il tampone che tampona la miscela a pH 6,9 ± 0,2.

Divulgazione delle prove e base interpretativa

Per dimostrare la reazione, è necessario eseguire uno sviluppo utilizzando due reagenti (reagenti Barrit), noti come Voges A e Voges B.

Voges A è una soluzione al 5% di α-naftolo e Voges B è un preparato di idrossido di potassio al 40%. Se l'idrossido di potassio non è disponibile, può essere sostituito con idrossido di sodio al 40%.

Α-Naphthol è un catalizzatore che aumenterà l'intensità del colore di reazione, rendendo il test più sensibile. L'α-naftolo deve essere sempre aggiunto per primo, agitando il tubo in modo che il mezzo venga a contatto con l'ossigeno. In questo modo l'acetoina presente viene ossidata a diacetile, e il 2,3-butandiolo viene ossidato per formare acetoina, passandola a diacetile.

È così che l'α-naftolo si legherà al diacetile, che a sua volta si è unito al nucleo guanidinico presente nell'amminoacido arginina, quest'ultimo proveniente dai pluripeptoni.

Da parte sua, l'idrossido di potassio o di sodio è responsabile dell'assorbimento della CO ₂ e della reazione con i peptoni. Questa reazione provoca la formazione di un colore rosa salmone, ben visibile dopo aver agitato molto bene la provetta.

Le quantità corrette di diacetile, peptone e α-naftolo devono essere miscelate affinché il colore si manifesti istantaneamente. Se ciò non accade, il tubo viene lasciato riposare per 15 minuti prima dell'interpretazione.

Il test è generalmente positivo dopo 2-5 minuti, quando è visibile un tenue colore rosa. Se lasciato riposare da 30 min a 1 ora, l'intensità del colore sarà massima (rosso intenso).

Quando il brodo diventa giallo, verrà visualizzato un test negativo. Dopo 1 ora, se il test è negativo, si può formare un color rame a seguito della reazione dell'idrossido di potassio su α-naftolo.

Preparazione

MR / VP medio

Pesare 17 g del terreno di coltura disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Lasciar riposare per 5 minuti. Riscaldare a ebollizione per sciogliere completamente. Servire 3-4 ml in provette e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.

Il terreno di coltura disidratato è di colore beige e il terreno preparato è di colore ambra chiaro.

Il pH finale del mezzo è 6,9 ± 0,2.

Voges Un reagente

Pesare 5 g di α-naftolo e sciogliere in 50 ml di alcol etilico (assoluto). Quindi continuare ad aggiungere alcol etilico fino a raggiungere i 100 ml.

Reagente Voges B.

Pesare 40 g di idrossido di potassio e scioglierlo in 50 ml di acqua distillata in un becher. Il bicchiere deve essere posto a bagnomaria fredda per controllare la temperatura, perché quando il preparato è sciolto, la temperatura aumenta bruscamente.

Dopo che la soluzione è fredda, viene trasferita in un matraccio volumetrico e portata a 100 mL con acqua distillata.

Procedura di prova Voges-Proskauer

Per eseguire il test Voges-Proskauer, un brodo RM / VP viene inoculato con il microrganismo in studio, da una coltura pura per 18-24 ore.

L'inoculo non dovrebbe essere molto denso. Viene incubato a 35-37 ° C per 24-48 ore, sebbene talvolta sia necessaria l'incubazione per diversi giorni. Cowan e Steel sono dell'opinione che 5 giorni sia il tempo minimo di incubazione necessario per rilevare tutte le specie Voges-Proskauer (VP) positive della famiglia delle Enterobacteriaceae.

Sviluppo di test

Separare un'aliquota da 1 mL in una provetta e svilupparla come segue: versare 12 gocce (0,6 mL) di reagente Voges A e 4 gocce (0,2 mL) di Voges B. Mescolare per aerare e lasciare sedimentare per 5 - 10 minuti prima dell'interpretazione. Tuttavia, se il test è ancora negativo, lasciarlo riposare e osservare la provetta dopo 30 minuti a 1 ora.

La comparsa di un colore rosso-rosato indica che la reazione di Voges-Proskauer è positiva. Se il mezzo rimane giallo la reazione è negativa.

Aggiungere sviluppatori nell'ordine e nella quantità indicati è essenziale per evitare falsi negativi.

Uso

Il test di Voges-Proskauer è utile per differenziare tra i ceppi di E. coli VP negativi, dei generi Klebsiella, Enterobacter, Serratia, tra gli altri, VP positivi.

Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.

QA

I ceppi di controllo, tra cui Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium e Enterobacter cloacae ATCC 13047, possono essere utilizzati per testare la qualità del terreno preparato.

I risultati attesi sono reazioni Voges-Proskauer positive solo per K. pneumoniae ed E. cloacae. Il resto dà reazioni negative.

Riferimenti

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015, disponibile su: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Disponibile: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Test biochimici per l'identificazione di batteri di importanza clinica. 3a ed. Editoriale Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.