SEQUENZIAMENTO DEL DNA: MAXAM-GILBERT, METODO ED ESEMPI - BIOLOGIA - 2024

Il sequenziamento del DNA (acido desossiribonucleico) è una procedura nei laboratori di biologia molecolare che permette di conoscere l'ordine dei nucleotidi nel materiale genetico di interesse. Inoltre, può essere divulgato anche il sequenziamento dell'RNA (acido ribonucleico).

Questa tecnica è stata indispensabile per lo sviluppo delle scienze biologiche. È applicabile anche ad altri campi della conoscenza, come la diagnosi medica e le indagini forensi, ad esempio.

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In precedenza, il sequenziamento di un filamento di DNA era considerato un'attività lenta e costosa, che consentiva l'identificazione di poche coppie di basi negli oligonucleotidi.

Oggi, con tutti i progressi della scienza, il sequenziamento del DNA è un'operazione di routine in molti laboratori in tutto il mondo grazie al contributo di quasi 50 anni di ricerca in questo campo. In termini di lunghezza della catena, è possibile sequenziare fino a milioni di coppie di basi in un tempo molto breve.

Per fare ciò, sono state sviluppate dozzine di tecniche che variano in termini di prezzo e precisione. In questo articolo descriveremo le tecniche sia classiche che moderne, ognuna con i suoi vantaggi e svantaggi.

Fino ad ora, le tecniche di sequenziamento consentono di ottenere la sequenza di genomi completi, dai piccoli procarioti e lieviti al genoma umano.

Struttura del DNA

Per comprendere i metodi e le tecniche utilizzate per il sequenziamento del DNA, è necessario conoscere alcuni aspetti chiave della struttura e della composizione della molecola.

Il DNA è una biomolecola presente in tutti gli esseri viventi, dai batteri ai grandi animali acquatici. Gli organelli, come i mitocondri e i cloroplasti, hanno una molecola di DNA circolare al loro interno. Anche in alcuni virus, il materiale genetico trovato è il DNA.

Strutturalmente, il DNA è una raccolta di nucleotidi. Ognuno è costituito da un carboidrato, una base azotata (A, T, C o G) e un gruppo fosfato. L'obiettivo del sequenziamento del DNA è rivelare l'ordine in cui le quattro basi azotate si trovano nella sequenza.

Storia

A metà degli anni '50, i ricercatori Watson e Crick descrissero la struttura del DNA usando tecniche cristolografiche. Tuttavia, nessuno di questi ricercatori era stato in grado di trovare un modo per svelare la sequenza.

Sebbene ci fossero alcuni predecessori, l'evento più importante fu la creazione del metodo Sanger, nel 1977. Frederick Sanger, il padre del metodo, era un biochimico britannico, vincitore di due premi Nobel per i suoi enormi contributi alle scienze biologiche.

Questa tecnica è anche nota in letteratura come "terminazione di catena" o dideoxinucleotidi. Di seguito verranno descritti i principi di questa tecnica e quelli sviluppati sulla base del suo miglioramento e innovazione.

Metodo Sanger

Lo sviluppo del metodo Sanger ha rappresentato un evento cruciale nella biologia molecolare. Coinvolge i componenti di base del processo di replicazione del DNA che normalmente avviene nella cellula, ma aggiungendo un componente speciale: i dideoxynucleotides.

Principali componenti della reazione

- DNA polimerasi: l'enzima DNA polimerasi è un elemento cruciale del processo. Questa molecola partecipa alla replicazione del filamento di DNA e il suo ruolo è la sintesi del nuovo filamento, accoppiando i desossiribonucleotidi trifosfati con quelli complementari.

Ricordiamo che nel DNA le timine (T) si accoppiano con le adenine (A) attraverso due legami idrogeno, mentre la citosina (C) lo fa con la guanina (G) attraverso tre legami.

- Nucleotidi: il sequenziamento di Sanger coinvolge due tipi di nucleotidi, i quattro 2'-deossinucleotidi (abbreviati come dATP, dGTP, dCTP e dTTP) ei quattro dideoxinucleotidi (ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP).

Sebbene i dideoxinucleotidi siano simili ai monomeri che sono normalmente incorporati nel DNA, mancano di un gruppo -OH nella loro struttura. Ciò rende impossibile aggiungere un nuovo nucleotide alla catena.

Pertanto, quando un nucleotide speciale viene aggiunto - in modo del tutto casuale - alla catena in formazione, la sintesi viene paralizzata. Quindi, alla fine della reazione, ci sono catene di diverse dimensioni, ognuna in cui la reazione è stata interrotta in un punto diverso.

Sperimentalmente, vengono preparati quattro test. Ciascuno contiene il DNA estratto dal campione biologico di interesse, i nucleotidi normali e uno dei quattro tipi speciali di nucleotidi. O i nucleotidi speciali sono contrassegnati con qualche tipo di marker fluorescente (vedere sequenziamento automatizzato di seguito).

Leggere i risultati

Il primo passo è separare ciascuna delle catene sintetizzate in base alla loro dimensione. Alcuni saranno più lunghi di altri, a seconda di dove sono state incorporate le basi speciali.

Esistono diverse tecniche biochimiche che consentono la separazione dei componenti di una miscela utilizzando la dimensione come proprietà discriminatoria. Nel metodo di Sanger, le diverse catene sono separate mediante elettroforesi. Nelle varianti più sofisticate della tecnica viene utilizzata l'elettroforesi capillare.

Pertanto, i fili più lunghi viaggiano meno delle varianti più corte. Questo sistema passa poi attraverso un lettore che riconosce il marker incluso in ogni dideoxynucleotide. In questo modo è possibile conoscere l'ordine della sequenza.

Questa tecnica di "prima generazione" è in grado di leggere frammenti di DNA non più grandi di 1 kilobase. Attualmente, il metodo Sanger è utilizzato in vari laboratori, generalmente nelle sue varianti moderne. Inoltre, viene utilizzato per corroborare i risultati ottenuti con le tecniche più complesse, ma meno precise.

Sequenza automatica

Quando il sequenziamento è richiesto su larga scala, il processo viene accelerato attraverso l'automazione. Questa è una variazione del metodo di terminazione della catena di Sanger, in cui i primer sono etichettati con prodotti fluorescenti per distinguerli.

Successivamente, il prodotto di reazione viene eseguito in elettroforesi, il tutto su una singola corsia. Quando ogni frammento esce dalla porzione finale del gel, viene rapidamente identificato dalla sua etichettatura fluorescente, con un errore intorno all'1%.

I sistemi più sofisticati hanno un sistema fino a 96 tubi capillari gestiti da un computer accoppiato ad un robot. Cioè, 96 campioni di DNA possono essere testati simultaneamente. Pertanto, il processo che coinvolge l'elettroforesi e l'analisi dei risultati è completamente automatizzato.

In un giorno, questi sistemi possono sequenziare fino a 550.000 basi. Durante il processo, il lavoro umano non è necessario, occorrono solo circa 15 minuti per avviare il metodo.

Sequenza di Maxam-Gilbert

Nello stesso momento in cui Sanger ha pubblicato il suo lavoro, due ricercatori di nome Allan Maxan e Walter Gilbert sono riusciti a sviluppare un altro metodo per ottenere la sequenza di DNA. Il metodo ha guadagnato popolarità all'epoca, ma in seguito è stato sostituito dal miglioramento del metodo di Sanger.

Contrariamente al metodo Sanger, il sequenziamento di Maxan e Gilbert (o sequenziamento chimico, come è anche noto) non comporta reazioni di ibridazione. La metodologia consiste nell'etichettatura con agenti reattivi a un'estremità, seguita da un processo di purificazione.

Uno degli aspetti negativi di questa tecnica risiede nella sua enorme complessità e nell'utilizzo di sostanze chimiche pericolose per l'utente. Le rotture chimiche sono indotte dall'applicazione di DMS, acido formico, idrazina e idrazina con sali.

Processi

Il protocollo inizia con la marcatura all'estremità 5 'del filo con il marcatore di fosforo 32, quindi si verifica una modifica chimica della base azotata che viene separata. Infine, si verifica la scissione della regione abasica.

Per prima cosa accorcia la stringa che vuoi mettere in sequenza in segmenti più piccoli. Questo passaggio viene eseguito con enzimi di restrizione, che si traducono in estremità sporgenti.

Successivamente, la reazione viene eseguita con una fosfatasi alcalina, il cui scopo è eliminare il gruppo fosfato. Pertanto, una chinasi polinucleotidica può essere utilizzata per eseguire l'etichettatura.

La catena è denaturata (i due fili si aprono). Quindi vengono applicati i prodotti chimici. Queste reazioni di scissione vengono eseguite in modo controllato ed è noto quali tipi di legami si rompe ciascuna chimica applicata.

Leggere i risultati

Come nel metodo Sanger, la lettura dei risultati prevede la separazione per dimensione delle catene ottenute in un sistema di elettroforesi. Sistemi composti da poliacrilammide consentono di ottenere una risoluzione molto adeguata per la lettura del gel.

Sequenziamento di massa

Il sequenziamento massiccio comprende una serie di nuovi metodi, abbreviati in NGS, dall'inglese "Next Generation Sequencing".

I metodi classificati come NGS richiedono una precedente fase di amplificazione del DNA (non funzionano con una singola molecola). Inoltre, le piattaforme utilizzate variano notevolmente. Di seguito verranno descritti i principi dei metodi più diffusi:

Pyrosequencing

Implica il monitoraggio del rilascio di un pirofosfato, che si verifica ogni volta che un nuovo nucleotide viene aggiunto al filamento di DNA. Un sistema di enzimi è accoppiato, in modo che l'emissione di luce (che è rilevabile da una telecamera) avvenga ogni volta che viene incorporato un nuovo nucleotide.

Il processo inizia con l'incubazione separata di ciascuna base di azoto per verificare se c'è o meno emissione di luce. Il pirosequenziamento può leggere fili lunghi, ma il tasso di errore rilevato è alto.

Sequenziamento della sintesi

Ciò comporta l'incorporazione di nucleotidi etichettati. Questi componenti fluorescenti vengono aggiunti, lavati e viene annotato il nucleotide incorporato. Quindi, l'etichetta nucleotidica viene rimossa e la sintesi del filo può continuare. Nella fase successiva, verrà incorporato anche un nucleotide marcato e verranno ripetute le fasi di cui sopra.

Uno svantaggio di questa tecnica si verifica quando i marker fluorescenti non vengono completamente rimossi. Queste emissioni creano errori di fondo, che si traducono in errori significativi.

Sequenziamento della legatura

Questa tecnica differisce dalle altre, in quanto non utilizza la DNA polimerasi. Invece, l'enzima chiave per questa metodologia è la ligasi. Qui vengono utilizzati frammenti di DNA marcati in modo fluorescente, è collegato dall'enzima e viene rilevato.

Il problema più grande con questa tecnica è la breve lunghezza del frammento che è in grado di elaborare.

Sequenziamento del torrente ionico

Questa tecnica si basa sulla misurazione dello ione H ⁺ che viene rilasciato ogni volta che viene incorporato un nuovo nucleotide. Il principio è abbastanza simile al pirosequenziamento, ma molto più economico.

Esempi

Il sequenziamento del genoma umano

Il sequenziamento del genoma umano è stata una delle sfide più promettenti in biologia, oltre ad essere una delle rivalità più acclamate nella storia della scienza. In effetti, per gli scienziati coinvolti nel progetto, il sequenziamento del genoma è diventato una competizione.

Nel 1990 ha avviato quello che è stato chiamato il "progetto sul genoma umano", guidato dal famoso scienziato, vincitore del Premio Nobel, James Watson. Dopo un anno, nel 1991, Venter accetta la sfida di "battere" Watson e sequenziare il genoma prima di lui. Tuttavia, nel 1992, Watson si ritirò e il comando fu preso da un altro ricercatore.

Nel 1995 Venter ha annunciato il suo successo nel sequenziamento completo di un genoma batterico con il metodo del sequenziamento casuale. Allo stesso modo, la squadra avversaria ha annunciato un anno dopo il sequenziamento del genoma del lievito.

Nel 2000 la laurea è stata terminata. Entrambe le società hanno pubblicato i risultati preliminari dell'intero genoma in due delle riviste scientifiche più prestigiose: Nature e Science.

Tuttavia, gli scienziati hanno continuato a lavorare per migliorare le proposte e nel 2006 sono state completate le sequenze di alcuni cromosomi umani.

Importanza e applicazioni

Conoscere l'ordine dei nucleotidi di una molecola così importante come il DNA è prezioso per i biologi e i professionisti correlati. Questa catena di polinucleotidi contiene tutte le informazioni necessarie per lo sviluppo e il mantenimento di tutte le forme di vita.

Per questi motivi, la conoscenza di questa sequenza è essenziale per la ricerca biologica. Fondamentalmente, il sequenziamento consente di misurare una delle proprietà più importanti dei sistemi biologici e di stabilire differenze tra loro.

Il sequenziamento è ampiamente utilizzato da tassonomi e sistematici, poiché alcune sequenze di DNA consentono di stabilire criteri per concludere se due organismi appartengono o meno alla stessa specie, oltre a poter proporre ipotesi sulle relazioni filogenetiche tra loro.

Inoltre, il sequenziamento del DNA ha applicazioni in medicina e diagnostica. Ad esempio, esistono sistemi economici e accessibili che, attraverso il sequenziamento, consentono di valutare la tendenza a sviluppare determinate malattie (come il cancro) utilizzando i cosiddetti polimorfismi a singolo nucleotide (SNP).

Anche le indagini di tipo penale e forense sono state arricchite con tecniche di sequenziamento, che possono essere utilizzate come prova attendibile della partecipazione di un determinato individuo a un crimine.

Riferimenti

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