TEST OSSIDASI: LOGICA, PROCEDURA E USI - BIOLOGIA - 2025

Il test dell'ossidasi è un metodo diagnostico che mostra la presenza del complesso enzimatico chiamato citocromo ossidasi c. Questo sistema induce la trasformazione del citocromo ridotto ad ossidato, poiché cattura l'ossigeno e questo a sua volta funge da ultimo accettore di elettroni (H ⁺ ) nella catena respiratoria.

Il termine ossidasi è un modo abbreviato per riferirsi all'enzima citocromo ossidasi, noto anche come indofenolo ossidasi. Nei tempi antichi si credeva che gli enzimi citocromo ossidasi e indofenolo ossidasi fossero due enzimi diversi, ma oggi si sa che sono gli stessi.

Test ossidasi positivo e negativo. Fonte: nessun autore leggibile dalla macchina fornito. Presunto Alpha.prim ~ commonswiki (basato su rivendicazioni di copyright).

Da parte loro, i citocromi sono emoproteine ​​che contengono ferro e completano il sistema della citocromo ossidasi. I citocromi possono variare da specie a specie.

Esistono diverse varietà di citocromi (citocromi a1, a2, a3 e 0). Alcuni batteri possono produrne solo uno, ma altri fino a due o tre alla volta. In questo senso, la presenza del citocromo a e a3 è nota come citocromo ossidasi c. Questo è il tipo di citocromo rilevato dal test dell'ossidasi.

I generi Neisseria e Pseudomonas contengono citocromo ossidasi c. Questi generi danno il test positivo per l'ossidasi, aiutando a differenziarli rispettivamente dai generi Acinetobacter e Stenotrophomonas.

Ci sono anche altri generi che sono ossidasi positivi.

Base

Caratteristiche del sistema citocromo ossidasi c

Il sistema della citocromo ossidasi c funziona nel modo seguente: i microrganismi ossidasi positivi utilizzano l'ossigeno per generare energia attraverso la respirazione aerobica. Questo sistema funziona grazie al trasporto di elettroni da sostanze donatrici come NADH ⁺ a sostanze recettrici, in questo caso ossigeno.

Ciò si traduce nella produzione di energia (ATP) e acqua o perossido di idrogeno, a seconda del sistema della citocromo ossidasi che il microrganismo possiede.

Ecco perché la maggior parte dei batteri ossidasi positivi sono anche catalasi positivi, condizione necessaria per eliminare il perossido di idrogeno prodotto, poiché questa sostanza è tossica per i batteri.

Il sistema citocromo ossidasi c è presente in alcuni batteri aerobi, in alcuni anaerobi facoltativi, in pochi microaerofili e in nessun anaerobi stretti. Quest'ultimo è comprensibile, poiché gli anaerobi stretti non possono vivere in presenza di ossigeno, quindi mancano del sistema della citocromo ossidasi.

Principio di prova

In questo test utilizza sostanze che agiscono come accettori di elettroni artificiali, sostituendo quelle naturali all'interno della catena di trasporto degli elettroni.

Principalmente vengono utilizzati coloranti come la parafenilendiammina e l'indofenolo, che agiscono come substrati recettoriali e donatori di elettroni artificiali.

La parafenilendiammina è ossidata dal sistema della citocromo ossidasi c. Il colorante nella sua forma ridotta è incolore, ma nella sua forma ossidata è colorato.

In questo modo viene evidenziata la presenza del sistema citocromo ossidasi c; poiché una reazione positiva genererà un colore lavanda o blu-viola a seconda del reagente utilizzato.

D'altra parte, se l'ultima sostanza che accetta gli elettroni nella catena respiratoria è diversa dall'ossigeno, il test dell'ossidasi sarà negativo (non c'è produzione di colore); questo è il caso dei microrganismi anaerobici.

Allo stesso modo, se il citocromo utilizzato dal microrganismo è diverso dalla citocromo ossidasi c, darà anche il test negativo.

Processi

Esistono vari reagenti e protocolli per il test dell'ossidasi, tutti per lo stesso scopo.

Reagenti

Reagente Kovacs, reagente Gordon e McLeod, reagente Nadi, reagente Carpenter, Suhrland e Morrison e uso di dischi ossidasi.

-Reagente Kovacs ossidasi

È costituito dall'1% di tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato.

Il reagente di Kovacs viene preparato sciogliendo 1 g della suddetta sostanza in 50 ml di acqua distillata. Viene riscaldato leggermente fino a completa dissoluzione. Trasferire in una bottiglia color ambra di capacità sufficiente e portare il volume a 100 ml con acqua distillata. Attendere almeno 15 minuti prima dell'uso. Conservare in frigorifero al riparo dalla luce.

È etichettato come reagente ossidasi Kovacs, per differenziarlo dal reagente Kovacs utilizzato per rivelare il test dell'indolo. Questo reagente è il più sensibile, meno tossico ma più costoso del resto dei reagenti.

Una reazione positiva sarà evidenziata con questo reagente con il cambiamento di colore della colonia in lavanda, che diventa rapidamente viola quasi nero. È evidente una reazione negativa perché non c'è cambiamento di colore nella colonia o assume una leggera colorazione rosata. Il mezzo può anche scurirsi, ma ciò non significa una reazione positiva.

Con questo reagente, il tempo di reazione è fondamentale, un cambiamento di colore che si verifica tra 5 e 15 secondi è considerato una reazione positiva.

-Gordon e McLeod reagente

È composto da dimetil-p-fenilendiammina dicloridrato, noto anche come N-dimetil-p-fenilendiammina o p-amminodimetilanilina monocloridrato. Viene preparato come descritto per il reagente ossidasi Kovacs, in sostituzione della sostanza coinvolta.

Questo reagente è leggermente più stabile del reagente ossidasi Kovacs, sebbene tutti i reagenti contenenti p-fenilendiammina siano instabili.

Questa reazione è tardiva, viene interpretata come positiva con la comparsa di un colore blu-viola entro 10-30 minuti.

-Nadi reagente

È composto da 1% di α-naftolo in alcool etilico (95% di etanolo) e 1% di amminodimetilanilina. La miscela viene preparata in parti uguali e utilizzando alcool etilico assoluto come diluente, fino a ottenere una quantità sufficiente per 100 ml.

-Carpenter, Suhrland e Morrison reagenti

È composto da 1% di ossalato di p-amminodimetilalanina. Preparare nello stesso modo descritto per il reagente ossidasi Kovacs, cambiando per la sostanza corrispondente.

Con la soluzione pronta, le strisce reattive vengono preparate come segue: le strisce di carta da filtro Whatman n. 1 di 6-8 cm vengono impregnate con reagente dimetil-p-fenilendiammina ossalato all'1%.

Possono asciugare senza contatto con il metallo, conservare in barattoli con tappo a vite con essiccante e conservare in frigorifero. Queste strisce sono stabili fino a 6 mesi.

È il reagente più stabile di tutti quelli citati e può durare fino a 6 mesi in soluzione. Un altro punto a favore è che non colora il terreno intorno alla colonia, se viene utilizzato direttamente sul piatto.

L'aspetto di un colore rosso è interpretato come un test positivo.

-Dischi ossidasi

Sono dischi commerciali impregnati di reagente per il test dell'ossidasi. Ci sono diversi marchi commerciali sul mercato.

Il suo utilizzo è abbastanza pratico, poiché non è necessario preparare reagenti freschi, il che facilita il lavoro. I risultati ottenuti sono affidabili purché i dischi siano adeguatamente conservati.

Protocolli

Metodo diretto su piastra, metodo indiretto su carta e utilizzo di dischi impregnati con reagenti ossidasi.

-Metodo di bordo diretto

A questo scopo vengono aggiunte 2 o 3 gocce di uno qualsiasi dei suddetti reagenti direttamente sulla o sulle colonie contenute in una piastra di terreno di coltura che non contiene glucosio.

Viene interpretato il cambiamento o meno di colore delle colonie, non del terreno. Il tempo di reazione valido dipende dal reagente utilizzato.

-Metodo indiretto su carta

Taglia un pezzo di carta da filtro (Whatman n. 1) a una dimensione di 6 cm ² e posizionalo all'interno di una capsula di Petri vuota.

Aggiungere 2 o 3 gocce del reagente ossidasi Kovacs sulla carta, prendere parte della colonia da studiare con manico di platino o stuzzicadenti di legno e stenderla in linea retta sulla carta impregnata di reagente. Interpretare entro 5-10 secondi.

Con le strisce preparate con i reagenti Carpenter, Suhrland e Morrison, una colonia viene stesa sulla striscia asciutta. Una singola striscia viene utilizzata per testare diversi ceppi. Interpreta in 10 sec.

-Dischi (m

Inumidire leggermente i dischi commerciali con acqua distillata sterile e sovrapporli alla colonia da studiare. Si consiglia di utilizzare le piastre a 35 ° C, se si utilizzano piastre a temperatura ambiente o piastre refrigerate la reazione è un po 'più lenta. Interpretare il cambio di colore tra 10 e 20 sec.

Possono essere utilizzate colonie contenute su agar sangue o cioccolato.

-Dischi (metodo indiretto)

Inumidire il disco come descritto in precedenza. Mettilo in una capsula di Petri vuota. Prendi una quantità sufficiente della colonia da studiare con un manico di platino o uno stuzzicadenti di legno e posizionala sul disco. Interpretare il cambio di colore tra 10 e 20 sec.

Uso

Il genere Neisseria e Acinetobacter sono talvolta molto simili morfologicamente perché anche se il genere Acinetobacter è un bastoncino Gram-negativo, a volte può assumere una forma coccoide ed essere distribuito a coppie, simulando il genere Neisseria.

In questo caso il test dell'ossidasi è davvero utile. Il genere Neisseria è positivo e Acinetobacter negativo.

Tuttavia, il genere Moraxella è molto simile al genere Neisseria ed entrambi danno una reazione positiva; Questo è il motivo per cui devono essere sempre eseguiti test di fermentazione dei carboidrati per l'identificazione definitiva.

D'altra parte, il test dell'ossidasi è utile per differenziare un batterio appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae (tutte ossidasi negative) da altri fermentatori, come il genere Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (ossidasi positive).

Anche il genere Vibrio e Helicobacter sono ossidasi positivi.

QA

Utilizzare ceppi noti di Escherichia coli come controllo negativo e ceppi di Pseudomonas aeruginosa come controllo positivo.

limitazioni

-I reagenti devono essere usati appena preparati, la loro durata in soluzione a temperatura ambiente è breve perché sono molto instabili. Refrigerati possono durare da 5 giorni a 2 settimane.

-I reagenti sono incolori, se cambiano colore devono essere scartati. I dischi danneggiati si presentano perché si scuriscono nel tempo.

-Una reazione positiva con il reagente Kovacs ossidasi tra 15-60 secondi è considerata una reazione ritardata e dopo 60 secondi dovrebbe essere considerata negativa.

-Haemophylus influenzae dà una reazione ossidasi negativa se viene utilizzato un reagente con dimetil-p-fenilendiammina, ma positiva se viene utilizzato il reagente ossidasi di Kovacs (tetrametil-p-fenilendiammina).

-I mezzi contenenti glucosio interferiscono con il test, dando falsi negativi.

-I ceppi di bordetella pertussis possono dare una reazione falsa positiva se provengono da piastre di agar sangue altamente concentrate.

-L'uso di maniglie in metallo (ferro) dà una reazione falsa positiva.

raccomandazioni

-Poiché i reagenti sono molto instabili e tendono ad autoossidarsi, si consiglia di congelare aliquote da 1 a 2 ml e di rimuoverle secondo necessità.

-Un altro modo per ritardare l'autoossidazione del reagente è aggiungere lo 0,1% di acido ascorbico durante la preparazione dei reagenti.

-Poiché i reagenti sono instabili, si consiglia un controllo di qualità settimanale.

-I reagenti che non superano il test di controllo qualità non devono essere utilizzati.

Riferimenti

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