TEST DELLA CATALASI: LOGICA, TECNICA E USI - BIOLOGIA - 2025

Il test della catalasi è una metodologia utilizzata nei laboratori di batteriologia per rivelare la presenza dell'enzima catalasi in quei batteri che lo possiedono. Insieme alla colorazione di Gram, sono i principali test da eseguire sui microrganismi appena isolati. Questi test guidano il microbiologo sui passaggi da seguire per l'identificazione definitiva del microrganismo in questione.

In generale, i batteri contenenti citocromo possiedono l'enzima catalasi, il che significa che i batteri aerobici e anaerobici facoltativi dovrebbero possederlo. Esistono tuttavia delle eccezioni, come lo streptococco, che pur essendo microrganismi anaerobici facoltativi, non possiede l'enzima catalasi.

Esecuzione del test della catalasi, che mostra una reazione positiva. Fonte: nessun autore leggibile dalla macchina fornito. Presunto Nase (in base alle rivendicazioni sul copyright).

Questo è il motivo per cui il test della catalasi viene utilizzato principalmente per distinguere le famiglie Staphylococaceae e Micrococaceae (entrambe catalasi positive) dalla famiglia Streptococaceae (catalasi negativa).

Allo stesso modo, il genere Bacillus (catalasi positiva) si distingue, tra gli altri, dal genere Clostridium (catalasi negativa).

Base

La catalasi è un enzima classificato come idroperossidasi, questo significa che usano il perossido di idrogeno (H ₂ O ₂ ) come substrato .

È anche considerato un'ossidoreduttasi, poiché nella reazione a cui partecipa c'è un elemento che funge da donatore di elettroni (sostanza riducente) e un altro da recettore di elettroni (sostanza ossidante).

La catalasi è una proteina che contiene un gruppo proserico con quattro atomi di ferro trivalenti (Fe ⁺⁺⁺ ), quindi è un'omoproteina. Lo ione ferrico rimane ossidato durante la reazione.

Si può dire che la catalasi è un enzima disintossicante, poiché la sua funzione è quella di eliminare le sostanze prodotte durante il metabolismo batterico che sono tossiche per i batteri. Tra queste sostanze c'è il perossido di idrogeno.

Il perossido di idrogeno si forma dalla scomposizione aerobica degli zuccheri. Questo processo avviene come segue:

Lo ione superossido (O ₂ ^- ) (radicale libero) si forma come prodotto finale dell'assimilazione del glucosio per via aerobica. Questo è tossico e viene eliminato dall'enzima superossido dismutasi che lo trasforma in ossigeno gassoso e perossido di idrogeno.

Il perossido di idrogeno è anche tossico per i batteri e deve essere rimosso. L'enzima catalasi scompone il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno.

La catalasi può agire su substrati diversi dal perossido di idrogeno, come alcoli, aldeidi, acidi, ammine aromatiche e fenoli. Tuttavia, il perossido di idrogeno può anche essere utilizzato dalla catalasi per ossidare altri composti tossici come l'alcol metilico ed etilico.

Allo stesso modo, la catalasi è presente nelle cellule fagocitiche, proteggendola dall'azione tossica del perossido di idrogeno.

Tecnica di routine per il test della catalasi

-Metodo di scorrimento

materiali

Perossido di idrogeno al 3% (10 volumi).

Vetrino da microscopio

Manico in plastica usa e getta o stuzzicadenti in legno.

Processi

Prendi abbastanza della colonia da studiare senza toccare l'agar da cui proviene. La colonia deve essere fresca, cioè da una cultura di 18 a 24 ore.

Posizionare la colonia sul vetrino asciutto e aggiungere una goccia di perossido di idrogeno al 3% (si può anche usare il 30% di H ₂ O ₂ ). Osservare immediatamente se vengono rilasciate o meno bolle.

Interpretazione

Reazione positiva: evoluzione del gas, evidenziata dalla formazione di bolle (forte gorgogliamento).

Reazione negativa: nessuna formazione di bolle.

-Metodo diretto in coltura pura

Posizionare 1 ml di 3% H ₂ O ₂ su una piastra pura o su una coltura a cuneo che non contiene sangue (preferibilmente agar nutriente). Osservare se si formano immediatamente o meno bolle. Può essere utilizzato anche il 30% di H ₂ O ₂ .

Viene interpretato allo stesso modo del metodo porta object.

-Metodo con tubo capillare o Fung e Petrishko

Riempire un tubo capillare da 67 mm fino a un'altezza di 20 mm con perossido di idrogeno al 3% per capillarità.

Toccare la colonia isolata da studiare con il capillare riempito con il 3% di H ₂ O _{2 .} Osservare se il capillare si riempie di bolle in circa 10 secondi. Questo metodo consente la semi-quantificazione della reazione in croci:

Senza croci non ci sono bolle (reazione negativa).

+ ---- Poche bolle (reazione debole o ritardata).

++ --– Bolle abbondanti (reazione moderata).

+++ - Le bolle raggiungono l'estremità opposta (forte reazione).

-Metodo Taylor e Achanzar per i test della catalasi che danno dubbi

Posizionare una colonia isolata su un vetrino pulito e asciutto, quindi posizionare una goccia di 0,5% H ₂ O ₂ e coprire con un vetrino. Osservare se c'è o meno la formazione di bolle intrappolate.

Interpretazione: la presenza di bolle indica una reazione positiva. Nessuna bolla, viene interpretata come una reazione negativa.

Test della catalasi per le specie Mycobacterium

Questa tecnica deve essere eseguita controllando il pH e la temperatura. Deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare, poiché la manipolazione delle diverse specie di Mycobacterium è pericolosa.

-Materiali

Perossido di idrogeno al 30% o 110 volumi (superossale).

Tampone fosfato pH 7

10% Tween 80

Mycobacterium wedge culture per 3 o 4 settimane

-Preparazione

Tampone fosfato pH 7

Pesare:

1,361 g di fosfato monopotassico anidro (KH ₂ PO ₄ ).

1.420 g di fosfato di disodio anidro (Na2HPO3).

Sciogliere entrambi i sali in poca acqua distillata sterile e portare a 1000 ml con acqua.

10% Tween 80

Fare una diluizione 1:10 al Tween 80 commercialmente concentrato, per fare ciò procedere come segue:

Prendete 1 ml di Tween 80 e mettetelo in poca acqua distillata, scioglietelo e quindi portate il volume con acqua a 10 ml.

Reagente finale

Mescolare una quantità di tampone fosfato con una quantità di Tween 80 al 10% (parti uguali). Definisci in laboratorio quanto vuoi preparare.

-Processi

Mettere 5 ml di tampone fosfato in una provetta sterile con tappo a vite (bachelite).

Con un'ansa da inoculazione, prendere una quantità sufficiente di colonia di una crescita di Mycobacterium seminata a spicchi e scioglierla nel tampone fosfato.

Tappare il tubo senza stringere eccessivamente la filettatura. Mettere a bagnomaria a 68 ° C per 20-30 minuti. Sfornare e lasciare raffreddare a 22-25 ° C

Misurare 0,5 ml del reagente finale (miscela) e aggiungerlo alla provetta con la soluzione fredda. Osservare la formazione o meno di bolle.

Viene interpretato come le tecniche precedenti.

Uso

Quando si ottiene la crescita delle colonie in terreni arricchiti, è necessario eseguire una colorazione di Gram e un test della catalasi sulle colonie ottenute. Questo guiderà il microbiologo sulle procedure da seguire per l'identificazione definitiva.

Fonte: preparato dall'autore MSc. Marielsa gil

QA

Per valutare le buone prestazioni del reagente al perossido di idrogeno, utilizzare ceppi di controllo appena coltivati, come Staphylococcus aureus come controllo positivo e ceppi di Streptococcus sp come controllo negativo.

Un'altra alternativa che serve come controllo positivo è quella di posizionare una goccia di perossido di idrogeno sull'agar sangue, gli eritrociti hanno catalasi, quindi, ci sarà un gorgoglio se il reagente è in buone condizioni.

Un agar cioccolato può essere utilizzato come controllo negativo, qui gli eritrociti sono già lisati e il test è negativo.

limitazioni

-Non utilizzare vecchie culture per il test, poiché ciò può causare falsi negativi.

-Evitare di prelevare colonie da colture su agar sangue, se si sta attenti a non toccare l'agar; Questa procedura può portare a falsi positivi, poiché i globuli rossi contengono catalasi.

-Se prendi la colonia con un manico in platino, non invertire l'ordine della procedura perché questo può generare falsi positivi. Questo perché il platino è in grado di reagire con il perossido di idrogeno, provocando un gorgoglio.

-Non utilizzare il reagente perossido di idrogeno se è molto vecchio, in quanto il reagente è molto instabile e tende a decomporsi nel tempo.

-Tenere il reagente perossido di idrogeno al riparo dalla luce e refrigerato per evitare danni.

-Effettuare un controllo di qualità del reagente al perossido di idrogeno ogni volta che viene utilizzato.

-Tieni presente che se si utilizza il 30% di H ₂ O ₂ , le reazioni sono più forti di quelle effettuate con il 3% di H ₂ O ₂ .

Riferimenti

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Test biochimici per l'identificazione di batteri di importanza clinica. 3a ed. Editoriale Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. BD Laboratories. Reagente catalasi-Gotario. Disponibile su: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Perossido. Equivalenza tra volumi e percentuale. Disponibile su: vadequimica.com