- Caratteristiche della proteinasi K.
- Attività enzimatica
- applicazioni
- Vantaggi della proteinasi K
- Proteine resistenti alla proteinasi K.
- Riferimenti
La K proteinasi è un enzima appartenente al gruppo delle serina proteasi, cioè ha al centro un amminoacido serina cataliticamente attivo e ha la funzione di rompere i legami peptidici per idrolisi. A sua volta, questo enzima appartiene alla famiglia delle proteine subtilisine (peptidasi S8).
La proteinasi K ha un peso molecolare (MW) di 28.900 dalton ed è stata isolata per la prima volta nel 1974 in estratti del fungo Engyodontium album, precedentemente noto come Tritirachium album Limber.
Struttura molecolare della proteinasi K. Fonte: Lykchiniadis
Possiede un'elevata capacità proteolitica, dimostrata dalla capacità di degradare la cheratina presente nel capello. La parola cheratina in inglese si scrive "cheratina", quindi è stata chiamata "proteinasi K".
A causa del suo elevato potere di scindere le proteine native, questo enzima è utile in varie tecniche di biologia molecolare. Viene utilizzato principalmente per isolare e preparare acidi nucleici ad alto peso molecolare (MW).
La proteinasi K agisce rilasciando il DNA nucleare, mentre distrugge le proteine e inattiva le RNasi e le DNasi, cioè elimina le nucleasi nei preparati di DNA e RNA.
D'altra parte, si è visto che la proteinasi K può idrolizzare alcune proteine native denaturate, cosa che ha suscitato l'interesse dei ricercatori per il suo utilizzo nello studio delle proteine prioniche (PrPC).
Tuttavia, nonostante la loro elevata potenza proteolitica, ci sono proteine resistenti all'azione della proteinasi K. Tra queste vi sono alcune proteine anomale chiamate prioni (PrPSc), associate a encefalopatie spongiformi trasmissibili.
Caratteristiche della proteinasi K.
La proteinasi K ha una struttura terziaria composta da tre strati, con un foglio β a sette catene interposto tra due strati di eliche. Poiché appartiene alla famiglia S8 delle peptidasi, è caratterizzata dall'avere una triade catalitica nel suo sito attivo, il cui ordine sequenziale è (Asp, His e Ser), che le differenzia dalle altre famiglie di peptidasi.
Questo enzima del gruppo delle serina proteasi è caratterizzato dall'idrolisi dei legami peptidici vicini al gruppo carbossilico degli amminoacidi alifatici e aromatici.
D'altra parte, è in grado di agire in presenza di alcune sostanze corrosive, come il dodecil solfato di sodio (SDS), il Tris-HCL e l'EDTA, che vengono utilizzati per aiutare la denaturazione delle proteine, facendole perdere la loro struttura nativa.
Questo è un passaggio preliminare nella preparazione delle proteine per la tecnica di elettroforesi. L'intervallo di pH in cui agisce la proteinasi K è piuttosto ampio (da 2,0 a 12,0), con un pH ottimale compreso tra 7,5 e 12,0 e il suo punto isoelettrico è 8,9. Come si può vedere, è attivo contro un intervallo di pH molto ampio.
Un'altra caratteristica che spicca nella proteinasi K è la sua stabilità in presenza di alte temperature (50 - 60 ° C).
Attività enzimatica
La proteinasi K richiede la presenza dello ione calcio, sebbene questo non influisca sulla sua attività, se è essenziale per mantenerne la stabilità.
Affinché la proteinasi K digerisca completamente il substrato, è necessario un tempo di contatto da circa 5 minuti a 2 ore.
Tuttavia, in questo senso, Daza et al hanno confrontato la purezza del DNA ottenuto in diversi momenti di esposizione contro la proteinasi K e hanno concluso che un'incubazione prolungata (fino a 24 ore) migliora significativamente la qualità del DNA.
Tuttavia, in relazione alla concentrazione dell'enzima proteinasi K utilizzato nei diversi protocolli, si può dire che è molto varia.
Può essere utilizzato da concentrazioni molto basse (5 µg / ml) a concentrazioni di 500 µg / ml. Ma le concentrazioni di lavoro più comuni vanno da 50 a 100 μg / ml, soprattutto per la digestione delle proteine e l'inattivazione delle nucleasi. Sebbene per il trattamento dei tessuti sia necessaria una concentrazione di 2 mg / ml.
applicazioni
Le sue applicazioni sono molto ampie e possono essere riassunte come segue:
-È utilizzato nella digestione delle proteine e nell'estrazione del DNA con diversi metodi come: salatura, PK-SDS, bromuro di cetil-trimetilammonio (CTAB), acetato di potassio modificato ed estrazione con ioduro di sodio.
-Inattivazione delle nucleasi (RNasi e DNasi).
-Nella tecnica di ibridazione in situ (HIS), per favorire il rilascio di acido nucleico, oltre ad eliminare le proteine indesiderate.
-Modificazione delle proteine.
-A livello di ricerca, in vari studi.
Vantaggi della proteinasi K
Sono stati effettuati diversi studi comparativi tra le tecniche di estrazione del DNA che utilizzano la Proteinasi K, con altre che non la utilizzano e tutti concludono che ci sono maggiori benefici quando si utilizza l'enzima. I vantaggi includono quanto segue:
-Si ottiene DNA di alto peso molecolare, di alta qualità e purezza.
-Il DNA estratto è stabile fino a 3 mesi.
Il DNA estratto può essere utilizzato nelle seguenti tecniche: Southern blot, reazione a catena della polimerasi (PCR), elettroforesi, tra le altre.
Proteine resistenti alla proteinasi K.
Diverse indagini hanno concluso che i prioni (proteine PrPSc tossiche anormali) differiscono dalle proteine PrPC (native) per la resistenza all'azione della proteinasi K, mentre le PrPC sono sensibili alla sua azione.
Altri autori hanno descritto che nella struttura di PrPSc ci sono porzioni sensibili e altre resistenti alla proteinasi K. Tuttavia, entrambe le parti sono ugualmente tossiche e infettive.
D'altra parte, Bastian et al.Nel 1987 hanno isolato 4 proteine di 28, 30, 66 e 76 kda da una specie di Spiroplasma mirum. Tutti sono risultati resistenti all'azione della proteinasi K e hanno anche avuto una reazione crociata con alcuni prioni.
È noto che questa specie può causare cataratta e importanti danni neurologici e grazie alle scoperte scientifiche di Bastian, tra le altre indagini, è stato fatto un tentativo di collegare questo microrganismo con le encefalopatie spongiformi trasmissibili.
Tuttavia, l'eziologia di questa patologia neurologica degenerativa continua ad essere attribuita ai prioni oggi.
In questo senso, Butler et al.Nel 1991 hanno identificato e caratterizzato una classe di proteine resistenti alla proteinasi K di 40 kda da due ceppi di Mycoplasma hyorhinis. Questo patogeno colpisce i suini, infettando i loro tessuti, ma in questo caso non c'è stata alcuna reazione crociata con i prioni testati.
Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire molte incognite a questo proposito.
Riferimenti
- Bastian F, Jennings R e Gardner W. 1987. L'antisiero alla proteina fibrillare associata alla scrapie reagisce in modo crociato con le proteine fibrillari di Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Valutazione di un metodo di estrazione e purificazione del DNA da tessuto muscolare fissato in formaldeide di cadaveri non identificati. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
- Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E e Mcgarrity G. Identificazione e caratterizzazione delle proteine resistenti alla proteinasi K nei membri della classe Mollicutes. Infezione e immunità, 1991, 59 (3): 1037-1042
- López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Confronto di due protocolli di estrazione di DNA di Trypanosoma cruzi coltivati in mezzo axenico. Rev. Perù. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. Disponibile su: scielo.org
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