CAMERA DI NEUBAUER: STORIA, CARATTERISTICHE, USI - BIOLOGIA - 2025

La camera di Neubauer , ematometro o emocitometro, è uno strumento da laboratorio costituito da una speciale lastra di vetro spesso. Questa fotocamera viene utilizzata per eseguire il conteggio di alcuni tipi di cellule come globuli rossi, globuli bianchi e piastrine, sebbene possa essere utilizzata per contare spore, sperma, parassiti, ecc.

Presenta delle caratteristiche molto peculiari, in quanto si compone di 3 zone, una centrale per il conteggio e due zone di appoggio. Ogni camera ha due zone di conteggio o mirini, uno in alto e uno in basso.

Camera di Neubauer. Fonte: SantiBadia. Immagine modificata.

Questi hanno più divisioni in una griglia. Le aree di conteggio sono i quadrati medi che si trovano ai 4 angoli di entrambi i reticoli, più il quadrato centrale.

L'assemblaggio della telecamera deve essere eseguito con grande cura, poiché ogni dettaglio influenza il conteggio delle cellule. Ci sono molti errori che possono essere commessi, ma se si verifica qualcuno di essi, la telecamera deve essere smontata, pulita e rimontata. Gli errori principali includono quanto segue:

Traboccamento della camera o riempimento insufficiente, lasciando asciugare la camera, tentando di rimuovere il liquido in eccesso con una garza, inclinando la camera durante il trasporto, riempiendo una camera sporca o umida, non mescolando bene la diluizione o il campione, tra gli altri. Tutti questi errori si tradurranno in un valore irreale.

Storia

La camera Neubauer è uno strumento di precisione e il processo di produzione è sottoposto a un rigoroso controllo di qualità. È stato creato per il conteggio preciso di particelle o elementi formati per mm ³ , come le celle in vari liquidi. La sua grafica delicata è scolpita con una matita diamantata.

Caratteristiche della camera di Neubauer

L'intera camera ha le dimensioni di un normale vetrino in modo che possa essere posizionata sul tavolino del microscopio.

La camera è costituita da tre superfici rettangolari centrali (a, b, c). Nella zona “b” si trova la zona R o zona di conteggio, chiamata anche reticolo. Uno su ciascun lato della telecamera, separato dalla zona "d".

Schema grafico della Camera di Neubauer. Fonte: Guida pratica all'ematologia. Scuola di Bioanalisi dell'Università di Carabobo, Venezuela.

Ogni reticolo è un'area lucida che contiene l'area di conteggio incisa. È costituito da un quadrato con una superficie di 9 mm ² ed è suddiviso internamente in 9 quadrati con una superficie di 1 mm ² ciascuno. I quattro quadrati angolari sono divisi in 16 quadrati più piccoli (0,0625 mm ² di area).

Queste griglie sono formate da una serie di linee millimetriche che si intersecano tra loro, costituendo griglie perfettamente rappresentate graficamente delimitate alle misure che sono state specificate. Queste linee sono state incise con una punta di diamante.

Reticolo Neubauer migliorato. Fonte: Guida pratica di Ematologia della Scuola di Bioanalisi dell'Università di Carabobo, Venezuela.

I quattro lati corrispondono all'area di conteggio. È su questi lati o angoli che viene contata la maggior parte delle cellule (globuli rossi e leucociti), mentre le piastrine vengono contate nell'area centrale.

La zona centrale ha più divisioni, è costituita da un quadrato di 1 mm ² diviso in 25 quadrati che hanno una superficie di 0,04 mm ² ciascuno. Questi a loro volta sono suddivisi in 16 griglie con un'area di 0,0025 mm ² .

Descrizione del reticolo Neubauer migliorato. a) piazza degli angoli, b) piazza centrale, c) piazza mediana della piazza centrale. Fonte: Guida pratica di Ematologia della Scuola di Bioanalisi dell'Università di Carabobo, Venezuela.

Le zone "a" e "c" servono come supporto per posizionare uno speciale oggetto di copertura chiamato diapositiva ematometrica o copertura ematometrica.

L'altezza tra il foglio e la superficie di conteggio è di 0,1 mm. Le misure della superficie dei tally box, così come l'altezza della camera e la diluizione del campione, sono dati necessari per effettuare i calcoli finali.

applicazioni

Viene utilizzato per il conteggio delle cellule. È particolarmente utile in ambito ematologico, poiché consente il conteggio delle 3 serie di globuli; cioè globuli rossi, globuli bianchi e piastrine.

Tuttavia, può essere utilizzato in altre aree, ad esempio per contare spermatozoi, spore, batteri o altri elementi importanti a seconda del tipo di campione.

Come usare?

preparazione del campione

Per eseguire il conteggio delle cellule, generalmente si inizia da una diluizione precedente. Esempio: per contare i globuli bianchi, preparare una diluizione 1:20 con il liquido di Turk. La diluizione viene miscelata bene prima di caricare la pipetta e montare la camera Neubauer.

Ci sono momenti in cui una diluizione 1:20 non è sufficiente per contare. Ad esempio, in pazienti affetti da alcuni tipi di leucemie croniche. In questi casi, dovrebbero essere effettuate diluizioni più elevate come 1: 100.

Se invece il conteggio è molto basso, come nelle leucopenie gravi, è possibile effettuare diluizioni minori per concentrare il campione. Esempio: puoi fare una diluizione 1:10.

Le modifiche apportate influenzano i calcoli.

Montaggio della camera Neubauer

La camera Neubauer viene assemblata posizionando il vetrino ematometrico nella zona centrale. Entrambi devono essere molto puliti e asciutti. Per posizionare la lamella, viene presa dai bordi e fatta cadere delicatamente sulla fotocamera.

Questo viene riempito posizionando la punta di una pipetta o pipetta automatica Thoma a un angolo di 35 ° sul bordo della zona di caricamento. Il liquido viene scaricato senza problemi e l'area di carico viene riempita per capillarità. Questo viene fatto da entrambi i lati per caricare i due mirini.

I reticoli non devono essere sovraccaricati e non si deve negare loro il liquido. Il carico deve essere esatto. È importante che il ripieno sia fatto in modo omogeneo, cioè non ci dovrebbero essere bolle.

Una volta assemblata la camera, si lascia riposare per 2 minuti in modo che le cellule precipitino sul fondo e la loro visualizzazione e conteggio sia più facile.

Dopo il tempo di riposo, viene montato sul tavolino del microscopio ottico per l'osservazione. Prima si focalizza con un obiettivo 10X e se necessario poi si va a 40X.

Per migliorarne la visualizzazione, il passaggio della luce dal microscopio è ridotto. Per fare ciò, il condensatore viene abbassato e il diaframma viene leggermente chiuso.

Conteggio

Per il conteggio dei globuli bianchi o leucociti, è necessario contare l'intera superficie dei quattro quadrati angolari mediani e il quadrato centrale di ciascun reticolo.

Il conteggio inizia nella casella nell'angolo in alto a sinistra. Inizi dal primo quadrato della prima fila, cioè da sinistra a destra fino a raggiungere l'estremità opposta.

Là scendi e guardi indietro da destra a sinistra fino a raggiungere l'altra estremità, e così via, le celle all'interno di ciascuna griglia vengono contate a zigzag. Vengono contate le 16 griglie di ogni quadrato mediano.

Per evitare di contare due volte una cella, esistono delle regole sulle celle che si trovano sulle linee di confine di ogni griglia. Le celle a sinistra e le righe in alto vengono contate e le celle a destra e in basso vengono ignorate.

Deve essere disponibile un contatore di cellule manuale in modo che l'operatore prema il tasto del dispositivo tante volte quante sono le celle osservate. Con l'utilizzo del contatore, l'operatore può contare senza dover alzare lo sguardo dal campo microscopico. Alla fine del conteggio, vedrai il numero totale di celle contate.

calcoli

Per i calcoli puoi procedere in diversi modi. È possibile contare un singolo reticolo o entrambi e calcolare la media di entrambi. In queste due situazioni, le celle contate devono essere moltiplicate per un fattore, che in questo caso sarebbe 40. E così ^{si ottiene} il conteggio totale per mm ³ .

Ma se le due griglie vengono contate e la media non viene presa, deve essere moltiplicata per un fattore diverso, in questo caso per 20.

-Fattore di moltiplicazione

Ecco come viene calcolato il fattore di moltiplicazione.

Vari dati sono presi in considerazione per i calcoli, tra cui il titolo di diluizione, l'altezza della camera e l'area contata.

Diluizione

La diluizione standard utilizzata è 1:20 per la conta dei leucociti.

Altezza della camera

L'altezza tra la camera e il foglio delle cellule del sangue è di 0,1 mm.

Area contata

Se vengono contati 5 quadrati di 1 mm ^{2 di} area, significa che l'area di conteggio totale è 5 mm ² . Questo dato deve essere moltiplicato per l'altezza della camera per ottenere il volume totale contato. Cioè, 5 mm ² x 0,1 mm = 0,5 mm ³ .

Formule e calcoli

Con i dati che abbiamo si dice:

Se in 0,5 mm ^{3 -} ci sono --- numero di celle contate

In 1 mm ³ --- ci saranno - X n ° di celle

Numero X di celle = (numero di celle contate x 1) / 0,5 mm ³

Ma anche la diluizione deve essere presa in considerazione. Pertanto, la formula è la seguente:

(numero di celle contate x 1) x 20 / 0,5 mm ³

Infine, per riassumere, il numero di cellule contate può essere moltiplicato per 40. Si ^ottiene così il valore di leucociti per mm ³ .

Se si contano i due reticoli, si cambia il dato dell'area contata, che in questo caso sarebbe 10 quadrati, cioè 10 mm ² . E un volume totale contato di 1 mm3. La formula sarebbe:

(numero di celle contate x 1) x 20/1 mm ³

Pertanto, in questo caso il fattore di moltiplicazione sarebbe 20.

Errori

-Se durante il caricamento della fotocamera viene superato o superato con del liquido, l'altezza della fotocamera varierà. Ciò si traduce in un conteggio superiore a quello reale. Se provi a rimuovere l'eccesso con una garza o del cotone, questo è un enorme errore. Questa azione farà sì che le cellule si concentrino, aumentando il conteggio.

-Se è caricato male, il conteggio sarà inferiore a quello reale.

-Se la telecamera viene montata e lasciata asciugare, non è più possibile contare perché darà risultati sbagliati.

-Se la diluizione del campione non viene miscelata bene prima di caricare la camera, c'è il rischio di un errore nella lettura, in quanto le celle non saranno distribuite in modo omogeneo. Pertanto, ci sarà una concentrazione di cellule inferiore o superiore, a seconda che il campione venga prelevato rispettivamente dalla superficie del liquido o dal fondo della provetta.

-La presenza di bolle riduce la quantità di liquido che deve entrare nel reticolo, interferendo con la corretta visualizzazione e distribuzione delle cellule. Tutto ciò influisce in modo significativo sui risultati.

-Durante il conteggio, non guardare in alto dal microscopio finché ogni grande quadrato non è stato completato per evitare di perdersi.

-Una ragione dell'errore è l'inclinazione della telecamera dopo il montaggio. Per questo motivo, il tavolino del microscopio deve essere sollevato con cura.

Raccomandazione

Se per qualsiasi motivo si rileva un'anomalia nel riempimento della camera, si consiglia di smontare quella preparazione, pulire la camera e rimontare da zero.

Fare molta attenzione quando si pulisce la fotocamera per evitare di graffiare il mirino. D'altra parte, tieni presente che il vetrino ematometrico è delicato e fragile. Un uso improprio può romperlo.

Prima di iniziare a contare, assicurati che le celle siano ben distribuite. Una distribuzione non uniforme delle cellule si verifica a causa di una scarsa miscelazione o diluizione del campione. Se questo accade, l'assemblaggio deve essere ripetuto.

Un modo per sapere se le celle sono ben distribuite è confrontando il conteggio di ogni quadrato grande, il numero di celle contate per ogni quadrato non dovrebbe essere esageratamente diverso l'uno dall'altro.

-Se la conta dei globuli bianchi è superiore a 50.000 mm ^{3, si} consiglia di ripetere il conteggio, effettuando una maggiore diluizione.

-Se si modifica la diluizione, è necessario ricalcolare il fattore di moltiplicazione, poiché questo influenza la formula.

Riferimenti

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5. Guida pratica di ematologia della Scuola di Bioanalisi dell'Università di Carabobo. Venezuela.1998