TAMPONE FOSFATO (PBS): LOGICA, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2025

Il tampone fosfato, tampone fosfato salino o BPS è un tampone isotonico, la cui funzione è quella di mantenere il pH e la pressione osmotica il più vicino possibile al naturale ambiente biologico (fisiologico). L'acronimo PBS sta per phosphate buffered saline.

Il PH e l'osmolarità sono due aspetti molto importanti che devono essere controllati in alcuni protocolli di laboratorio. Nel caso del pH, è essenziale che sia controllato, soprattutto nelle reazioni biochimiche, poiché queste possono variare o non essere eseguite se i reagenti hanno un pH inappropriato.

Soluzione salina tamponata con fosfato PBS a due diversi pH. Fonte: Pixinio.com

Nel frattempo, il controllo dell'osmolarità è essenziale soprattutto quando si lavora con cellule viventi, poiché le membrane plasmatiche delle cellule reagiscono in base alla concentrazione di soluti in cui si trovano.

Se le cellule vengono trasferite in un mezzo ipertonico si disidratano, poiché il gradiente dell'acqua verrà trasportato sul lato dove c'è una maggiore concentrazione di soluti. Se, d'altra parte, le cellule vengono poste in un mezzo ipotonico, le cellule assorbiranno il liquido fino a quando non saranno lisate.

Ecco perché il tampone PBS viene utilizzato per i protocolli di laboratorio che richiedono il mantenimento delle cellule in vitro, in questo modo le cellule non verranno danneggiate.

PBS è costituito da una combinazione di sali, come cloruro di sodio, fosfato di sodio, cloruro di potassio e fosfato di potassio. La composizione del PBS può variare a seconda del protocollo.

Base

Fondamentalmente la funzione del tampone fosfato è quella di mantenere un pH fisiologico costante insieme ad una concentrazione di elettroliti simile a quella che si trova all'interno dell'organismo.

In questo ambiente, le cellule sono in grado di rimanere stabili, poiché le condizioni fisiologiche vengono simulate il più possibile.

Altri composti possono essere aggiunti alla formulazione PBS originale se necessario, ad esempio l'aggiunta di EDTA al tampone è utile per lavare i globuli rossi nel test di incompatibilità incrociata.

L'EDTA impedisce che la frazione del complemento C1 presente nel siero venga scissa e lisata nei globuli rossi, ovvero evita falsi risultati di incompatibilità. Inoltre, l'EDTA aiuta a dissociare le cellule.

Preparazione

La quantità di sali che dovrà essere pesata per la preparazione della soluzione salina tamponata con fosfato PBS dipenderà dalla quantità che dovrà essere preparata:

-Soluzione stock salina tamponata con fosfato (10X PBS)

Per un litro di soluzione:

Pesare:

80,6 g di NaCl,

2,2 g di KCl,

11,5 g di Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Tecnica di preparazione

Mettere i sali pesanti in un becher, aggiungere acqua a sufficienza (80%) e mescolare sulla piastra con la barra magnetica fino a quando i sali non si saranno sciolti.

Preparazione di PBS utilizzando una piastra di agitazione con una barra magnetica. Fonte: Utente: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtro per rimuovere le particelle non disciolte. Utilizzare filtri con pori di 0,45 µm. Autoclavare e distribuire in modo asettico in cappa a flusso laminare in barattoli di vetro con coperchio.

La soluzione 10X (concentrata) non regola il pH. La regolazione viene effettuata una volta diluita alla concentrazione di tampone PBS 1X, (diluizione 1:10).

-Buffer fosfato salino (1X PBS)

1X PBS può essere preparato direttamente, pesando le quantità corrispondenti di ciascun sale, oppure può essere preparato diluendo la soluzione madre (1:10) con acqua distillata sterile.

-Per preparare direttamente un litro di soluzione salina tamponata con fosfato PBS 1X, pesare:

8,06 g di NaCl,

0,22 g di KCl,

1,15 g di Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g di KH ₂ HPO ₄

Tecnica di preparazione

Procedere come spiegato nella soluzione concentrata. Successivamente, il pH deve essere regolato. Per fare ciò, misurare il pH e, a seconda del risultato, utilizzare acido (HCl) o base (NaOH) per abbassare o aumentare il pH rispettivamente secondo necessità, fino a quando non è 7,4.

L'acido o la base vengono aggiunti goccia a goccia monitorando il valore del pH della soluzione utilizzando un pHmetro. Filtrare, sterilizzare in autoclave e distribuire asetticamente in provette coniche o barattoli secondo necessità.

-Per preparare 1X PBS dalla soluzione stock 10X:

Fai una diluizione 1:10. Ad esempio, per preparare 1 litro di 1X PBS, misurare 100 ml di soluzione madre e aggiungere 700 ml di acqua distillata sterile. Regolare il pH e riempire la quantità di acqua fino a 1000 ml.

Il tampone PBS preparato è incolore e limpido.

Daily PBS può essere conservato a temperatura ambiente e il resto in frigorifero.

Soluzioni per la regolazione del pH

HCl

Per 100 ml di 1 molare HCL (acido cloridrico).

Misurare 91 ml di acqua distillata e metterla in un becher da 250 ml.

Misura 8,62 ml di HCl concentrato e aggiungilo lentamente al becher contenente l'acqua (non farlo mai al contrario). Adottare le misure di biosicurezza appropriate quando si maneggiano acidi forti (sostanza altamente corrosiva).

Mescolare per 5 minuti preferibilmente utilizzando una piastra per mescolare con una barra magnetica all'interno del bicchiere. Trasferire in un matraccio da 100 ml e portare a 100 ml con H ₂ O distillata.

NaOH

Per 100 ml di NaOH (idrossido di sodio) 10 molare.

Misura 40 mL di acqua distillata e mettili in un becher da 250 mL. Misurare 40 g di NaOH e aggiungerlo all'acqua. Mescolare utilizzando una piastra per mescolare con una barra magnetica all'interno del bicchiere.

Trasferire in un matraccio tarato da 100 ml e portare a volume con acqua distillata. Rispettare le normative sulla biosicurezza, perché questa reazione è esotermica (rilascia energia sotto forma di calore).

Se vuoi preparare altre quantità di soluzione salina di fosfato, puoi consultare la seguente tabella:

Fonte: «Laboratorio di genomica virale e umana, Scuola di Medicina UASLP»

applicazioni

Viene utilizzato principalmente in biologia cellulare, immunologia, immunoistochimica, batteriologia, virologia e laboratori di ricerca.

È ideale per il lavaggio cellulare mediante centrifugazione (globuli rossi), lavaggi monostrato cellulare, nelle tecniche di ellissometria spettroscopica, nella quantificazione di biofilm batterici, nel mantenimento di colture cellulari per virus, come soluzione di lavaggio nella tecnica di immunofluorescenza indiretta e nelle tecniche per la caratterizzazione degli anticorpi monoclonali.

Viene anche utilizzato per il trasporto di cellule o tessuti, come diluente per il conteggio cellulare, la preparazione di enzimi cellulari (tripsina), come diluente per il metodo di essiccazione delle biomolecole e per preparare altri reagenti.

D'altra parte, Martin et al.Nel 2006 hanno dimostrato che la PBS è utile nei laboratori di scienze forensi, in particolare nel recupero dello sperma dagli strisci vaginali o nel recupero delle cellule vaginali dagli strisci del pene. In questo modo si può stabilire se c'è stata una relazione sessuale.

limitazioni

-Alcuni tamponi PBS contengono una sostanza chiamata sodio azide come conservante. Questo composto può generare sostanze esplosive se viene a contatto con piombo o rame. Per questo motivo, è necessario prestare particolare attenzione quando si smaltisce questo reagente nello scarico. Se viene scartato in questo modo, è necessario aggiungere molta acqua per diluirlo il più possibile.

-Zinco non deve essere aggiunto al tampone fosfato, poiché provoca la precipitazione di alcuni sali.

-Wangen e collaboratori nel 2018 hanno stabilito che l'uso del PBS non era adatto al lavaggio di cellule primarie di leucemia mieloide acuta (LMA) estratte dal sangue periferico, a causa del fatto che molte cellule vengono perse per lisi, con una forte diminuzione del materiale proteina.

Pertanto, hanno stabilito che le cellule AML primarie non devono essere lavate con PBS dopo la conservazione in azoto liquido.

Riferimenti

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