AGAR THAYER MARTIN: FONDAZIONE, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2024

L' agar Thayer Martin è un terreno selettivo altamente nutriente e solido per l'isolamento di Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae; entrambi noti come Neisserie patogene o clinicamente importanti.

Una delle caratteristiche speciali più importanti dell'agar Thayer Martin è il suo alto contenuto di integratori alimentari. Questa proprietà è essenziale, perché le Neisserie sono microrganismi molto esigenti dal punto di vista nutrizionale e quindi non crescono nei terreni comuni.

Thayer Martin / Agar Thayer Martin medio aziendale. Immagine di origine 1: scattata dall'autore MSc. Marielsa Gil, immagine 2. Pixinio.com batteriacolonizzato, modificato, Thayer, Martin, agar.

D'altra parte, poiché questi microrganismi si trovano normalmente in aree non sterili, l'aggiunta di inibitori è necessaria per impedire la crescita della flora accompagnatoria, senza pregiudicare lo sviluppo del genere Neisseria.

Questo agar è composto da agar GC base, emoglobina, supplementi nutrizionali aggiuntivi e un complesso di sostanze inibitorie (antibiotici e antimicotici). Le case commerciali vendono ciascuno dei supplementi separatamente.

Il campione da seminare in questo terreno dipenderà dal microrganismo che si sta cercando. Per Neisseria gonorrhoeae i campioni ideali sono le secrezioni vaginali e uretrali. Mentre per Neisseria meningitidis i campioni più utilizzati sono CSF, essudati faringei e rinofaringei.

Base

Le neisserie sono microrganismi classificati come fastidiosi e quindi il loro isolamento è difficile. Per questo motivo, il Thayer Martín è un mezzo complesso e ciascuno dei suoi componenti svolge una funzione che viene spiegata di seguito:

GC base agar

L'agar GC contiene peptone proteico, amido di mais, cloruro di sodio, fosfato dipotassico, fosfato monopotassico e agar-agar. I suoi componenti forniscono i nutrienti di base per lo sviluppo microbico, neutralizzano gli acidi grassi tossici, aiutano a mantenere l'equilibrio osmotico, definiscono il pH e forniscono una solida consistenza al mezzo.

Emoglobina

L'emoglobina fornisce i fattori V e X (nicotinamide adenina dinucleotide NAD ed emina rispettivamente). Per questo motivo, anche le specie Haemophilus crescono in questo terreno. L'emoglobina può essere ottenuta commercialmente in una forma disidratata oppure si può aggiungere sangue bovino defibrinato fresco al terreno.

Integratore di arricchimento

D'altra parte, al terreno Thayer-Martin deve essere aggiunto anche un integratore di arricchimento, poiché i nutrienti contenuti nell'agar di base non sono sufficienti per il fabbisogno del genere Neisseria.

L'integratore di arricchimento più comunemente usato si chiama isovitalex. Contiene glutammina, adenina, NAD, cocarbossilasi, guanina, nitrato ferrico, acido p-ammino benzoico, vitamina B12, tiamina e glucosio. Tutti questi composti sono necessari per il corretto sviluppo delle Neisserie patogene.

inibitori

Trattandosi di un terreno altamente nutritivo, è necessario utilizzare inibitori che impediscano la crescita di microrganismi dalla flora abituale della zona e favoriscano così l'isolamento del genere Neisseria.

Il complesso inibitore è composto da vancomicina, colistina e nistatina. La vancomicina inibisce la crescita di batteri Gram positivi, la colistina previene la crescita di batteri Gram negativi come Pseudomonas e alcuni Neisserias saprofiti e la nistatina agisce su lieviti come Candida albicans.

Tuttavia, Thayer Martin Agar è stato successivamente modificato; le modifiche consistevano nell'aggiunta di trimetoprim, nell'aumento della quantità di agar e nell'aggiunta di glucosio extra. Questi cambiamenti hanno migliorato significativamente il recupero delle specie Neisseria gonorrhoeae.

Va notato che trimetoprim inibisce la crescita del genere Proteus e la sua conseguente formazione brulicante. In questo senso, sono gli antibiotici a fornire il carattere selettivo al terreno Thayer Martin.

Preparazione

Agar Thayer Martin originale

-GC agar

Pesare 8,2 g di terreno GC disidratato e sospendere in 100 ml. Mescolare e far bollire per 1 minuto mescolando spesso per sciogliere completamente. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.

- 2% di emoglobina

Sospendere 2 g di emoglobina disidratata in 2 o 3 ml di acqua distillata calda fino a formare una miscela uniforme. Aggiungere poco a poco altra acqua per completare un volume di 100 ml. La sospensione deve essere omogenea prima della sterilizzazione.

Sterilizzare in autoclave per 15 minuti.

-Integratore di arricchimento

Ricostituire la fiala commerciale con il diluente fornito dalla stessa società commerciale. Mescolare bene. La quantità di diluente da utilizzare sarà specificata nelle istruzioni del kit.

-Integratore di inibizione del VCN (vancomicina, colistina, nistatina)

Ricostituire la fiala con il diluente fornito dalla società commerciale. Mescolare bene. La quantità di diluente da utilizzare sarà specificata nelle istruzioni del kit.

-Preparato

Per ogni 100 ml di GC agar procedere come segue:

Quando l'agar GC esce dall'autoclave, lasciarlo raffreddare a una temperatura di circa 50 ° C e aggiungere 2 ml della soluzione di emoglobina preparata, 2 ml del supplemento di arricchimento (isobitalex o britalex) e 2 ml del supplemento di inibizione. Mescolare e servire in piastre Petri sterili.

Lasciate solidificare e conservate in frigo fino al momento dell'uso.

Il colore del terreno preparato è rosso ciliegia. Il pH finale del mezzo è 7,2 ± 0,2

Agar Thayer Martin modificato

Pesare 8,2 g di terreno GC disidratato e sospendere in 100 ml. Aggiungere 1 g di agar-agar e aggiungere 0,3 g di glucosio. Mescolare e far bollire per 1 minuto mescolando spesso per sciogliere completamente. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.

Preparare l'emoglobina e il supplemento di arricchimento come descritto in precedenza.

Il supplemento di soppressione utilizzato è VCNT (vancomicina, colistina, nistatina, trimetoprim).

-Preparato

Procedere come descritto per l'agar Thayer Martin originale.

Uso

Lasciare riscaldare Thayer Martin Agar prima che i campioni vengano striati. I campioni comunemente usati sono tamponi faringei, tamponi nasali, secrezioni vaginali, uretrali e / o rettali e liquido cerebrospinale.

Utilizzare campioni freschi e fare inoculi forti sull'agar. I campioni vengono seminati direttamente dallo scarico del materiale e quindi l'esaurimento viene striato sulla superficie.

Le piastre vengono incubate a 35-37 ° C per 24-48 ore in un barattolo microaerofilo (5% CO ₂ ). Al termine del tempo di incubazione, le piastre vengono esaminate per individuare colonie piccole, grigie e talvolta mucose.

Eseguire Gram e test biochimici di conferma su colonie sospette.

QA

I seguenti ceppi microbici possono essere utilizzati per il controllo di qualità di Thayer Martin Agar.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 e Neisseria meningitidis ATCC 13090; si prevede uno sviluppo soddisfacente in entrambi i ceppi.

Devono essere inclusi anche i seguenti ceppi: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 e Candida albicans ATCC 10231. In tutti questi terreni è prevista un'inibizione totale o parziale.

limitazioni

-Dobbiamo tenere presente che i batteri resistenti agli inibitori utilizzati possono crescere nel terreno.

-Ci sono ceppi di Neisseria gonorrhoeae che possono essere sensibili alla concentrazione di vancomicina utilizzata. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare agar cioccolato integrato con isovitalex, ma senza inibitori.

-Ci sono ceppi di lievito resistenti alla nistatina che possono crescere in questo terreno e interferire con l'isolamento delle neisserie patogene, in particolare i gonococchi.

Riferimenti

1. Valtek Diagnostic Laboratories. Thayer-Martin Agar.2016. Disponibile su: com
2. Britannia Laboratories. Thayer Martin Medium modificato. 2010 Disponibile su: britanialab.com
3. Collaboratori di Wikipedia. Agar Thayer-Martin. Wikipedia, l'enciclopedia libera. 26 ottobre 2017, 16:33 UTC. Disponibile su: wikipedia.org 4. Accesso 28 febbraio 2019.
4. Britannia Laboratories. GC agar. 2010 Disponibile su: britanialab.com.
5. Laboratori BBL ™ Arricchimento medio per microrganismi esigenti. 1999. Disponibile su: bd.com
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.