L' agar TCBS è un mezzo di coltura solida altamente selettiva e differenziale, utilizzato per l'isolamento e la coltivazione di batteri del genere Vibrio, in particolare Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus come principali patogeni di questo tipo.
L'acronimo TCBS sta per Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Questo agar è anche noto come terreno selettivo per Vibrio. La formula originale è stata creata da Nakanishi e successivamente modificata da Kobayashi.
Terreno TCBS commerciale e piastra di agar TCBS seminata con Vibrio cholerae. Fonte: foto 1: scattata dall'autore MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, India
È composto da estratto di lievito, peptone di carne, triptein, citrato di sodio, tiosolfato di sodio, bile di bue, saccarosio, cloruro di sodio, citrato ferrico, blu di bromotimolo, blu di timolo e agar.
Questa composizione consente un adeguato sviluppo delle specie Vibrio da campioni di acqua, cibo e feci; ad eccezione del Vibrio hollisae, che non cresce su questo terreno. Inoltre, il terreno TCBS è in grado di inibire la crescita di altri batteri associati, in particolare i coliformi.
A causa dei gravi problemi gastrointestinali ed extra-intestinali prodotti da alcune specie del genere Vibrio, la sua diagnosi è molto importante. Gli esseri umani vengono infettati principalmente mangiando cibi crudi o poco cotti del mare o acque inquinate, ma anche attraverso l'infezione delle ferite.
Per questo motivo, i laboratori clinici devono includere l'agar TCBS nello studio della coltura delle feci di campioni di feci liquide, in particolare con l'aspetto dell'acqua di riso. Soprattutto se il paziente riferisce di essere stato a contatto con l'acqua di mare o di aver consumato crostacei o pesce.
Base
L'estratto di lievito, i peptoni di carne e il triptein sono la fonte nutritiva di questo mezzo. Tuttavia, l'agar TCBS è un terreno inospitale per la maggior parte dei batteri.
La sua elevata selettività è data dall'aggiunta di citrato di sodio e bile di bue; entrambi sono agenti inibitori che forniscono anche un pH alcalino al terreno, limitando la crescita della flora di accompagnamento e favorendo la crescita di V. cholerae, tra le altre specie. Va notato che Vibrio cholerae è molto sensibile all'acidità.
Da parte sua, il cloruro di sodio bilancia osmoticamente il mezzo. Inoltre, essendo elevata la sua concentrazione, agisce anche come agente inibitorio, favorendo la crescita dei batteri alofili.
Il saccarosio è lo zucchero fermentabile che, insieme agli indicatori di pH del blu di bromotimolo e del blu di timolo, conferisce al mezzo il suo carattere differenziale. Per questo motivo, con questo terreno è possibile differenziare i ceppi fermentanti il saccarosio da quelli non fermentanti.
Le colonie dei ceppi fermentanti il saccarosio sviluppano un colore giallo e trasformeranno il terreno da verde a giallo a causa della produzione di acido. I non fermentanti diventano traslucidi e il mezzo rimane il colore originale (verde).
Allo stesso modo, questo terreno contiene tiosolfato di sodio come fonte di zolfo e citrato ferrico come agente di sviluppo. Entrambi mostrano batteri in grado di produrre idrogeno solforato (gas incolore). H 2 S si forma da tiosolfato e successivamente, dopo aver reagito con citrato ferrico, si forma un visibile precipitato nero.
Infine, l'agar è ciò che fornisce la consistenza solida al terreno.
Preparazione
Pesare 89 g del terreno disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Aiuta la dissoluzione riscaldando e mescolando frequentemente. La miscela può essere bollita per un massimo di 2 minuti.
Questo mezzo non è autoclavato. Dopo lo scioglimento va servito direttamente su piatti sterili. Quando si solidificano, vengono disposte capovolte sulle piastrine e conservate in frigorifero (2-8 ° C) fino al momento dell'uso.
Il terreno dopo la preparazione deve rimanere a pH 8,6 ± 0,2.
Il colore del terreno disidratato è beige chiaro o beige verdastro e il colore del terreno è verde bosco o verde bluastro.
È importante lasciare che le piastre si riscaldino prima di seminare i campioni.
Uso
L'esemplare più comune per l'isolamento di Vibrio sono le feci diarroiche.
I campioni di feci, se non possono essere seminati immediatamente sul terreno selettivo, devono essere trasportati sul terreno Cary Blair.
Per aumentare la sensibilità della coltura, le feci possono essere fatte passare attraverso l'acqua di peptoni a pH 8,4 come mezzo di arricchimento per un massimo di 8 ore, da lì viene sottocolturato al terreno TCBS.
Va inoltre tenuto presente che alcuni ceppi di Vibrio possono causare setticemia in pazienti immunosoppressi, pertanto possono essere isolati da emocolture. Allo stesso modo, campioni di acqua e cibo dal mare possono essere analizzati quando ci sono focolai epidemici di malattia di colera.
Sown
L'inoculo del campione di studio deve essere prominente, la semina viene eseguita con il metodo della striatura per esaurimento. Le piastre vengono incubate a 37 ° C per 24 ore in aerobiosi.
Le presunte colonie di Vibrio cholerae sono di media grandezza, lisce, opache, con bordi sottili e di colore giallo per la fermentazione del saccarosio.
In modo simile crescono le specie V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii e alcuni V. vulnificus. Altre specie di Vibrio clinicamente importanti come V. parahaemolyticus non fermentano il saccarosio, sviluppandosi come colonie verde oliva.
Piastra di agar TCBS seminata con Vibrio parahaemolyticus. Fonte: isis325 Flickr
D'altra parte, va tenuto presente che alcuni ceppi di Aeromonas e Plesiomonas che sono ossidasi (+) possono crescere in questo terreno, sviluppando colonie gialle che possono confondere il clinico. Mentre alcuni ceppi di Pseudomonas anche ossidasi (+) crescono come colonie verdi come V. parahaemolyticus.
Limitazione
Il test dell'ossidasi positivo per il genere Vibrio non deve mai essere eseguito da colonie ottenute da TCBS agar, poiché il risultato ottenuto sarà un falso negativo. I composti nel mezzo interferiscono fortemente con questo test. Pertanto, deve essere ottenuto da sottocolture su agar sangue.
QA
Per dimostrare che il terreno è in buone condizioni, si consiglia di seminare ceppi di controllo noti o certificati e osservare se la crescita soddisfa le caratteristiche previste.
Per questo puoi usare ceppi di:
-Vibrio cholerae -– crescita soddisfacente (colonie gialle, bordo traslucido).
-Vibrio parahaemolyticus --– crescita soddisfacente (colonia con centro verde e bordo traslucido).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - crescita soddisfacente (colonie gialle con aloni dello stesso colore attorno alla colonia).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inibizione totale o parziale (piccole colonie gialle o traslucide).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– inibizione parziale o totale (colonie blu).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Completamente inibito.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Inibizione totale o parziale. (Piccole colonie verdi al centro bordo traslucido).
L'incubazione del terreno non inoculato deve rimanere invariata.
Riferimenti
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Agar TCBS. Disponibile su: f-soria.es
- Laboratorio BD. BD. TCBS Agar 2003, disponibile su: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS medio. 2015 Disponibile su: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016, disponibile su: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.