AGAR SABOURAUD: BASE, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2024

L' agar Sabouraud , noto anche come agar Sabouraud destrosio, è un terreno solido, particolarmente arricchito per l'isolamento e lo sviluppo di funghi, come lieviti, muffe e dermatofiti.

Pertanto, questo terreno non può mancare in un laboratorio di microbiologia per indagare la presenza di funghi patogeni o opportunisti, sia da campioni clinici che non clinici. Allo stesso modo, è anche ideale per la crescita di batteri filamentosi come Streptomyces e Nocardias. Il suo utilizzo è molto ampio, in quanto può essere utilizzato nella micologia umana, animale, vegetale e industriale.

A. Agar Sabouraud non seminato. B. Agar Sabouraud seminato con un lievito. Fonte: foto scattate dall'autore MSc. Marielsa gil

Questo mezzo è stato creato nel 1896 dall'importante dermatologo Raimond Sabouraud, che divenne uno specialista di fama mondiale nei disturbi del cuoio capelluto, principalmente causati da dermatofiti.

La sua creazione è stata così importante che da allora è stata utilizzata e rimane ancora oggi, anche se con alcune modifiche.

Sebbene sia speciale per i funghi, i batteri possono crescere in questo terreno, quindi, per i campioni con flora mista, è necessaria l'inclusione di antibiotici nella loro preparazione per inibire la crescita della flora batterica che può essere presente.

La scelta dell'antibiotico deve essere fatta con attenzione e tenendo conto del tipo di fungo da recuperare, poiché alcuni sono inibiti in presenza di determinate sostanze.

Base

Sabouraud destrosio agar è un terreno che nella sua formulazione originale è debolmente selettivo, a causa del suo pH acido di 5,6 ± 0,2, tuttavia, i batteri possono ancora svilupparsi, principalmente in incubazioni prolungate.

Il terreno contiene peptone di caseina e digestato pancreatico di tessuto animale, che forniscono la fonte di carbonio e azoto per la crescita di microrganismi.

Contiene anche un'alta concentrazione di glucosio, che funge da fonte di energia, favorendo la crescita dei funghi sui batteri. Tutto questo miscelato con agar-agar, componente che gli conferisce la giusta consistenza.

D'altra parte, l'agar per destrosio Sabouraud può essere selettivo se vengono aggiunti antibiotici.

Con gli antibiotici è particolarmente utile in campioni di ferite, ulcere aperte o qualsiasi campione in cui si sospetta una forte contaminazione batterica.

Combinazioni più comunemente usate di agar destrosio Sabouraud con antibiotici

-Agar Saburaud con cloramfenicolo: ideale per il recupero di lieviti e funghi filamentosi.

- Agar Sabouraud con gentamicina e cloramfenicolo: quasi tutti i funghi e lieviti filamentosi crescono in questo terreno e inibisce un gran numero di batteri, inclusi Enterobacteriaceae, Pseudomonas e Staphylococcus.

- Agar Sabouraud con cicloesimide: è particolarmente utile per i campioni della pelle o delle vie respiratorie, purché il sospetto sia funghi dimorfici.

La cicloesimide deve essere usata con cautela; Sebbene sia utilizzato per inibire la crescita di funghi e lieviti non patogeni o ambientali che possono essere presenti come contaminanti in un campione, inibisce anche la crescita di alcuni funghi come Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp e altri funghi opportunisti.

- Agar Sabouraud con cloramfenicolo più cicloesimide: è utilizzato principalmente per isolare dermatofiti e funghi dimorfici. Ha lo svantaggio di inibire alcune specie di funghi opportunisti come Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes o C. neoformans.

- Agar Sabouraud con cloramfenicolo, streptomicina, penicillina G e cicloesimide: è ideale per campioni estremamente contaminati da batteri e funghi saprofiti, ma ha lo svantaggio di inibire la crescita di Actinomyces e Nocardie, oltre ai funghi opportunisti sopra citati.

Preparazione

Se hai gli ingredienti separatamente, può essere preparato come segue:

Agar Sabouraud destrosio

Pesare:

- 40 gr di destrosio

- 10 g di peptone

- 15 gr di agar-agar

- Misurare 1000 ml di acqua distillata

Tutti gli ingredienti sono miscelati, il pH è regolato a 5,6. I soluti vengono sciolti per ebollizione, 20 ml del terreno vengono distribuiti in tubi da 25 x 150 mm, senza bordo e preferibilmente con un cappuccio di cotone.

Tubi con tappo in cotone. Fonte: foto scattata dall'autore MSc. Marielsa gil

È possibile utilizzare anche altre dimensioni di tubo, a seconda della disponibilità.

Sono sterilizzati in autoclave per 10 minuti a pressione atmosferica (121 ° C). Il tempo di sterilizzazione in autoclave non deve essere superato. All'uscita dall'autoclave i tubi vengono inclinati con l'ausilio di un supporto fino a solidificarsi in un becco a flauto.

Un altro modo è sciogliere gli ingredienti riscaldando finché non bolle. Autoclavare per 10 minuti nella stessa fiala e quindi distribuire 20 ml in piastre Petri.

Se si dispone di un terreno agar destrosio Sabouraud che contiene già tutti gli ingredienti, procedere a pesare la quantità specificata dalla società commerciale per un litro d'acqua. Gli altri passaggi sono gli stessi descritti sopra.

Agar destrosio Sabouraud (modifica Emmons)

Pesare:

- 20 gr di destrosio

- 10 g di peptone

- 17 gr di agar-agar

- Misurare 1000 ml di acqua distillata

Tutti gli ingredienti sono mescolati, il pH è regolato a 6,9. Procedi allo stesso modo del caso precedente.

Ci sono case commerciali che offrono il mezzo con tutti gli ingredienti. In questo caso, pesare e preparare come descritto sull'inserto.

Agar Sabouraud destrosio (modifica Emmons) con cloramfenicolo

Soluzione madre di cloramfenicolo

- Pesare 500 mg di base cloramfenicolo

- Misurare 100 ml di etanolo al 95%

- Mescolare

Il terreno agar destrosio Sabouraud (Emmons) viene preparato come descritto in precedenza e in aggiunta per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cloramfenicolo prima della sterilizzazione in autoclave.

Sabouraud Emmons Dextrose Agar with Cycloheximide

Soluzione madre di cicloesimide

- Pesare 5 gr di cicloesimide

- Misurare 100 ml di acetone

- Mescolare

Il terreno agar destrosio Sabouraud (Emmons) viene preparato come già descritto e inoltre per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cicloesimide prima della sterilizzazione in autoclave.

Agar Sabouraud destrosio (Emmons) con cloramfenicolo e cicloesimide

Il terreno agar destrosio Sabouraud (Emmons) viene preparato come descritto in precedenza e inoltre per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cloramfenicolo e 10 ml di soluzione madre di cicloesimide prima della sterilizzazione in autoclave.

Altri antibiotici che possono essere aggiunti

Da 20.000 a 60.000 unità di penicillina per litro di terreno.

30 mg di streptomicina per litro di terreno.

Entrambi devono essere incorporati dopo che il terreno è stato autoclavato, leggermente raffreddato (50-55 ° C).

0,04 g di neomicina per litro di terreno.

0,04 g di gentamicina per litro di terreno.

Considerazioni speciali

Per sicurezza, si preferisce seminare l'agar destrosio Sabouraud in provette a forma di cuneo (inclinate nel becco della scanalatura) piuttosto che in piastre di Petri, per evitare la dispersione e l'inalazione delle spore.

È importante che le provette di agar Sabouraud siano coperte con cotone e non con tappo a vite, poiché è stato dimostrato che condizioni semi-anaerobiche inibiscono la formazione di spore in alcuni ceppi, ad esempio Coccidioides immitis. Inoltre, la maggior parte dei funghi è aerobica.

In caso di utilizzo del tappo a vite, non chiudere ermeticamente.

QA

I supporti preparati devono essere sottoposti a controllo di qualità per verificarne il corretto funzionamento. Per questo, vengono seminati alcuni ceppi di controllo.

Per Sabouraud destrosio agar con cloramfenicolo possono essere utilizzati ceppi ATCC di Candida albicans, che devono avere una crescita eccellente. Un'altra piastra viene inoculata con ceppi di Escherichia coli, che devono essere completamente inibiti.

Viene inoltre incubata una piastra non inoculata in cui non devono crescere microrganismi.

Per l'agar Sabouraud destrosio con cloramfenicolo e cicloesimide possono essere utilizzati ceppi di Trichophyton mentagrophytes, che dovrebbero svilupparsi bene. Un'altra piastra viene inoculata con un ceppo di Aspergillus flavus, in cui deve esserci poca o nessuna crescita. Inoltre, una piastra non inoculata viene incubata per dimostrarne la sterilità.

Per Sabouraud destrosio agar con cicloesimide vengono utilizzati ceppi di Candida albicans, Trichophyton rubrum o Microsporum canis, che devono mostrare una buona crescita.

Allo stesso modo, è incluso un ceppo di Aspergillus flavus, che mostra poca o nessuna crescita. Infine, incubare una piastra non inoculata per controllare la sterilità.

applicazioni

Cultura primaria

L'agar destrosio Sabouraud classico contiene 4 grammi di destrosio ed è eccellente come mezzo di isolamento primario, poiché mostra la morfologia caratteristica di ciascun fungo.

È anche eccellente per dimostrare la produzione di pigmenti. Tuttavia, non è il mezzo migliore per osservare la sporulazione.

Inoltre è sconsigliato per la coltivazione di Blastomyces dermatitidis, che è inibito dall'elevata concentrazione di glucosio presente.

D'altra parte, per la coltivazione è necessario tenere conto di alcune considerazioni.

Alcuni funghi crescono meglio a temperatura ambiente, come le muffe, altri crescono con successo a 37 ° C, come alcuni lieviti, e altri possono crescere a entrambe le temperature (funghi dimorfici).

Per questo motivo, a volte è necessario utilizzare più piastre di agar Sabouraud per lo stesso campione, poiché la semina in duplicato viene spesso eseguita per incubare una piastra a temperatura ambiente e un'altra a 37 ° C.

Ad esempio, Sporothrix schenckii viene seminato in due piatti; una viene incubata a temperatura ambiente per ottenere la fase muffa e l'altra viene incubata a 37 ° C per ottenere la fase lievito, ma in quest'ultima è necessario aggiungere il 5% di sangue al terreno.

In altri casi, come i campioni di micetoma, vengono seminate due piastre di agar Sabouraud, una con cloramfenicolo e l'altra con cicloesimide. Il primo consentirà la crescita di agenti causali del micotoma di origine fungina (Eumycetoma) e il secondo agenti causali del micetoma di origine batterica, come gli actinomicetomi.

sporulazione

Emmons Modified Sabouraud Dextrose Agar contiene 2 grammi di destrosio e non viene utilizzato solo per l'isolamento, ma anche per la sporulazione e la conservazione dei funghi.

In questo terreno è possibile recuperare i ceppi di Blastomyces dermatitidis.

Conservazione

Per conservare le colture di funghi, possono essere conservate in frigorifero (2-8 ° C). Il tempo di conservazione può variare dalle 2 alle 8 settimane. Dopo questo tempo devono essere sottocolturati per ripetere il processo.

Alcuni funghi si conservano meglio a temperatura ambiente, come Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum e Microsporum audounii.

Il mantenimento del ceppo può essere allungato per evitare il pleomorfismo se il destrosio viene completamente rimosso dall'agar e se la quantità di agar nel terreno viene ridotta per evitare la secchezza.

microcolture

Per l'identificazione di alcuni funghi filamentosi, è necessario eseguire microcolture utilizzando l'agar Sabouraud o altri mezzi speciali per osservare le strutture della riproduzione sessuale e asessuata.

Nella micologia umana

Viene utilizzato principalmente per la diagnosi delle malattie fungine, in particolare quelle che colpiscono la pelle e le sue attaccature (capelli e unghie).

I campioni possono essere secrezioni, essudati, pelle, capelli, unghie, espettorato, liquido cerebrospinale o urina. I patogeni comunemente isolati sono dermatofiti, funghi che causano micosi sottocutanee e sistemiche.

Micologia animale

Gli animali sono spesso colpiti da infezioni fungine, quindi l'agar Sabouraud è utile nella micologia animale come lo è negli esseri umani.

Ad esempio, i dermatofiti possono spesso colpire gli animali. È il caso del Microsporum canis var distorsum, che infetta frequentemente cani, gatti, cavalli, maiali e scimmie. Allo stesso modo, Microsporum gypseum infetta cani, gatti e bestiame.

Uccelli come polli, galli e galline sono colpiti da Microsporum gallinae.

Altri funghi, come lo Zymonema farciminosum, sono anche causa di malattie negli animali, principalmente cavalli, muli e asini, producendo una significativa infiammazione nei vasi linfatici.

Sporothrix schenkii e Histoplasma capsulatum colpiscono gli animali domestici e gli esseri umani.

Micologia ambientale

Molti funghi patogeni o opportunisti possono concentrarsi in un dato momento in un dato ambiente, specialmente nelle sale operatorie e nelle unità di terapia intensiva (ICU) di cliniche e ospedali. Perciò è necessario effettuare un controllo di loro.

Altri spazi vulnerabili sono biblioteche e vecchi edifici, che possono essere interessati dalla concentrazione di funghi ambientali.

Negli studi ambientali, l'agar destrosio Sabouraud viene utilizzato per l'isolamento dei funghi.

Micologia industriale

L'agar destrosio Sabouraud non può essere assente per lo studio dei funghi contaminanti nella produzione di cosmetici, alimenti, bevande, cuoio, tessuti, tra gli altri.

Micologia vegetale

Le piante soffrono anche di malattie causate da funghi, che colpiscono diverse parti della pianta, che possono anche terminare il raccolto, causando grandi perdite in agricoltura.

Riferimenti

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