AGAR MRS: FONDAZIONE, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2024

L' agar MRS è una coltura selettiva di terreno solido utilizzata per l'isolamento e il conteggio dei batteri lattici, in particolare del genere Lactobacillus. Questo agar è stato creato nel 1960 da Man, Rogosa e Sharpe, con lo stesso nome, ma a causa della sua complessità viene spesso utilizzata l'abbreviazione MRS.

È composto da peptone proteico, estratto di carne, estratto di lievito, glucosio, monoleato di sorbitano, fosfato dipotassico, acetato di sodio, citrato di ammonio, solfato di magnesio, solfato di manganese e agar.

Man Rogosa e Sharpe Agar (MRS) seminati con Lactobacillus sp. Fonte: Foto donata per questo articolo dagli autori: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto scattata durante l'indagine dal titolo: Valutazione dei batteri dell'acido lattico e dei bifidobatteri con potenziale probiotico nel latte materno e nelle feci dei neonati .

Questa composizione consente il corretto sviluppo di batteri lattici da campioni clinici, come feci, perdite vaginali, campioni orali e latte materno, nonché latticini e alimenti a base di carne.

Non viene utilizzato di routine nei laboratori clinici, perché i batteri dell'acido lattico sono raramente coinvolti nei processi patologici. Tuttavia, nell'ambito della microbiologia alimentare, l'uso dell'agar MRS è più frequente.

Questo terreno è invece utilizzato da alcuni Centri di Ricerca il cui obiettivo è lo studio dei batteri lattici.

Base

L'agar Man, Rogosa e Sharpe ha una composizione abbastanza complessa. Scomponendo la funzione di ciascuno dei suoi componenti, è possibile spiegarne il fondamento.

Il peptone proteico, l'estratto di carne, l'estratto di lievito e il glucosio sono nutrienti che forniscono la fonte di carbonio, azoto, vitamine e minerali necessari per la crescita batterica. Inoltre, il glucosio è la fonte energetica universale utilizzata nella maggior parte dei terreni di coltura.

D'altra parte, per favorire la crescita dei batteri lattici, è necessaria la presenza di cofattori (cationi) essenziali nel metabolismo del Lactobacillus e dei batteri correlati; Questi composti sono i sali di sodio, magnesio e manganese.

Allo stesso modo, il monoleato di sorbitano o il polisorbato 80 sono un'importante fonte di acidi grassi in quanto vengono assorbiti come nutrienti.

Inoltre, il monoleato di sorbitano e il citrato di ammonio agiscono inibendo lo sviluppo della flora di accompagnamento, in particolare i batteri Gram negativi, fornendo il carattere selettivo di questo agar.

Infine, l'agar-agar è quello che fornisce la consistenza solida al terreno.

Esistono altre varianti dell'agar Man Rogosa Sharpe; uno di questi è integrato con cisteina (MRSc), molto utile per l'isolamento dei bifidobatteri, tra gli altri microrganismi. D'altra parte, c'è il terreno MRS integrato con neomicina, paromomicina, acido nalidixico e cloruro di litio, speciale per il conteggio selettivo dei bifidobatteri nei prodotti lattiero-caseari.

Preparazione

Pesare 68,25 grammi del mezzo disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Lasciar riposare per 5 minuti. Per dissolverlo completamente, passare a una fonte di calore, mescolando frequentemente e far bollire per 1 o 2 minuti. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.

Quando si lascia l'autoclave, lasciare riposare per alcuni minuti e distribuire ancora caldo in piastre Petri sterili.

Lasciar solidificare e capovolgere le piastre, ordinare in griglie e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso. Lasciare che i piatti si riscaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.

Il pH del mezzo dovrebbe essere 6,4 ± 0,2. Alcune case commerciali raccomandano un pH compreso tra 5,5 e 5,9.

Il terreno disidratato è di colore beige e preparato è di colore ambra scuro.

Sia il terreno disidratato che le piastre preparate devono essere conservate a 2-8 ° C.

applicazioni

Le piastre di agar MRS possono essere seminate in superficie (esaurimento o spatola di Drigalski). Può anche essere seminato in profondità. Le piastre devono essere incubate a 37 ° C in microaerofilia (4% O ₂ e 5-10% CO ₂ ) per 24-72 ore.

Il metodo di semina viene scelto in base allo scopo perseguito (isolamento o conteggio).

Caratteristiche delle colonie

Le presunte colonie di Lactobacillus crescono di colore biancastro e hanno un aspetto mucoide o cremoso su questo agar. Successivamente devono essere identificati.

Isolamento dei batteri lattici

Per questo, viene utilizzata la semina superficiale. I campioni da seminare richiedono una procedura precedente.

Nel caso di campioni di latte materno, si consiglia di centrifugare 1 ml del campione a 14.000 rpm per 10 minuti, al fine di rimuovere lo strato di grasso. 900 µl vengono scartati e nei restanti 100 µl il sedimento viene sospeso e versato sulla superficie dell'agar MRS, quindi distribuito uniformemente con una spatola Drigalski.

Nel caso di campioni di feci, un (1) grammo di feci viene pesato e omogeneizzato in 9 mL di acqua peptone sterile allo 0,1%, corrispondente a una diluizione 1/10. Quindi si effettuano diluizioni seriali, fino ad ottenere una diluizione finale di 10 ^-4 .

Infine, vengono prelevati 100 µl delle diluizioni 10 ^-2 , 10 ^-3 e 10 ^-4 e ciascuna diluizione viene seminata su agar MRS, distribuendo uniformemente con una spatola Drigalski.

Contano i batteri lattici

In questo caso la semina avviene in profondità.

Per i campioni di latte materno, 1 mL viene prelevato e posto in un tubo di plastica conico sterile. L'agar MRS viene aggiunto ad una temperatura approssimativa di 40 ° C ad un volume finale di 25 mL, ottenendo una miscela omogenea. Successivamente, viene versato in piastre Petri sterili in modo uniforme e lasciato riposare fino alla polimerizzazione.

Per i campioni di feci, vengono effettuate le diluizioni, come descritto in precedenza. Prendi 1 mL di ciascuna diluizione e posizionalo in provette di plastica coniche sterili. L'agar MRS fuso viene aggiunto a un volume di 25 mL.

La miscela di ciascuna diluizione viene versata in modo uniforme in piastre Petri sterili. Infine si lascia riposare fino alla polimerizzazione.

La colonia conta sull'agar Man Rogosa e Sharpe (MRS). Fonte: foto donata per questo articolo. Autori: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto scattata durante la ricerca dal titolo: Valutazione dei batteri dell'acido lattico e dei bifidobatteri con potenziale probiotico nel latte materno e nelle feci dei neonati.

Livello di ricerca

Ogni giorno lo studio dei batteri lattici sta guadagnando sempre più interesse; I ricercatori cercano in particolare di conoscere nuovi ceppi e il loro potenziale come fermenti di avviamento per la standardizzazione nella produzione di prodotti lattiero-caseari, tra gli altri usi.

In questo senso, Alvarado et al. (2007) hanno utilizzato l'agar MRS per condurre uno studio in cui hanno isolato, identificato e caratterizzato i batteri dell'acido lattico presenti in un formaggio venezuelano affumicato andino artigianale.

Nel formaggio hanno riscontrato la presenza di batteri dei generi Lactococcus e Lactobacillus e hanno concluso che le miscele di ceppi isolati sono adatti come ceppi di avviamento nella produzione di formaggi da latte pastorizzato.

D'altra parte, Sánchez et al. (2017) hanno utilizzato l'agar MRS per studiare la presenza di batteri lattici nel tratto digerente dei suinetti, al fine di utilizzarli come probiotici nativi che aumentano la produttività dei suinetti sani.

Con questo terreno sono riusciti a isolare quattro specie: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae e Pediococcus pentosaceus.

Allo stesso modo, Báez et al. (2019) hanno utilizzato l'agar MRS per valutare i batteri dell'acido lattico (LAB) e i bifidobatteri con potenziale probiotico nel latte materno e nelle feci dei neonati.

Sono riusciti a isolare 11 BAL e 3 Bifidobacteria sp nel latte materno e 8 BAL e 2 Bifidobacteria sp. nelle feci. Tutti hanno soddisfatto determinati parametri che li dimostrano come batteri con attività probiotica.

Gli autori hanno concluso che sia il latte materno che le feci dei neonati allattati esclusivamente al seno fungono da fonti naturali di batteri probiotici.

QA

Per valutare la qualità dell'agar MRS, controllare i ceppi come:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli e Bacillus cerei.

I risultati attesi sono una crescita soddisfacente per i primi 6 batteri, mentre E. coli e Bacillus cereus devono essere completamente inibiti.

Riferimenti

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Isolamento, identificazione e caratterizzazione dei batteri dell'acido lattico da un formaggio artigianale andino affumicato venezuelano. Il suo utilizzo come cultura iniziale. Ciente. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Disponibile su: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Isolation of Lactic Acid Bacteria from the Digestive Tract of the Piglet. Rev. investiga. veterinario. Perù 2017; 28 (3): 730-736. Disponibile su: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Valutazione dei batteri dell'acido lattico e dei bifidobatteri con potenziale probiotico nel latte materno e nelle feci dei bambini nel comune di Acevedo, Miranda 2017. Lavoro universitario per qualificarsi per la laurea in analisi biologiche. Università di Carabobo, Venezuela.
4. Britannia Laboratory. MRS agar. 2015 Disponibile su: britanialab.com
5. Collaboratori di Wikipedia. MRS agar. Wikipedia, l'enciclopedia libera. 10 gennaio 2018, 19:44 UTC. Disponibile su: wikipedia.org Accesso 17 febbraio 2019.
6. Roy D. Media per l'isolamento e il conteggio dei bifidobatteri nei prodotti lattiero-caseari. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.