Il terreno agar Endo o Endo è un terreno solido, differenziale e con un certo grado di selettività. La formula originale è stata creata da Endo nel 1904 per differenziare i batteri fermentanti il lattosio dai batteri non fermentanti. Inizialmente era stato progettato per l'isolamento della Salmonella typhi, ma in seguito l'obiettivo del mezzo si è rivolto alla ricerca di coliformi.
Il principio di Endo Agar è rimasto, ma la sua formulazione ha subito innumerevoli modifiche nel corso degli anni. Attualmente, il terreno è composto da digest peptico di tessuto animale, lattosio, fosfato di idrogeno dipotassio, solfito di sodio, fucsina basica e agar.
A: Virgin Endo Agar B: Seeded Endo Agar, al centro dell'agar si può notare la lucentezza metallica di un ceppo di E. coli. Fonte: A: Strolch1983 / B: LenkaM
L'utilizzo principale del terreno è stato collegato all'isolamento e alla differenziazione di bacilli Gram negativi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae e ad altre famiglie vicine.
Per molto tempo è stato utilizzato nella rilevazione di coliformi in campioni di acqua, latticini e alimenti, ma oggi l'uso di questo mezzo è stato sostituito da altri con funzioni simili. Tuttavia, alcuni laboratori di microbiologia utilizzano questo agar per l'isolamento di Enterobacteriaceae da campioni di origine clinica.
Base
Endo agar contiene peptoni che fungono da fonte di amminoacidi, azoto, carbonio ed energia, necessari per la crescita di microrganismi poco esigenti.
D'altra parte, il carattere leggermente selettivo dell'agar è fornito dall'aggiunta di solfito di sodio e fuchsina basica; entrambi i componenti inibiscono parzialmente o totalmente la crescita della maggior parte dei batteri Gram positivi.
Il carattere differenziale è dato dalla presenza del carboidrato fermentescibile, che in questo caso è il lattosio e la fucsina basica, che funge anche da indicatore di pH.
I batteri Gram-negativi che crescono su questo agar e sono in grado di fermentare il lattosio formeranno forti colonie rosa; essendo patognomonico di Escherichia coli la formazione di colonie rosso scuro con una lucentezza metallica verdastra iridescente. Ciò è dovuto all'elevata produzione di acidi dalla fermentazione dei carboidrati.
Va notato che anche il terreno intorno alle colonie assume un colore rosa intenso. Mentre i bastoncini Gram negativi non fermentanti il lattosio formano colonie rosate pallide simili al terreno o incolori.
Il dipotassio idrogenofosfato bilancia il pH del terreno e l'agar è il componente che fornisce la consistenza solida.
Preparazione
Endo agar
Pesare 41,5 g del terreno disidratato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. Riscaldare la miscela mescolando frequentemente fino a completa dissoluzione del terreno. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C, a una pressione di 15 libbre, per 15 minuti.
Al momento dell'estrazione dall'autoclave, lasciare raffreddare a una temperatura di circa 45-50 ° C, agitare la miscela per omogeneizzare prima di servire. Versare 20 ml in piastre Petri sterili.
Lasciar solidificare i piatti, capovolgerli e conservarli in un plaquero o avvolgerli con carta scura prima di riporli in frigorifero. È molto importante proteggere il terreno preparato dalla luce diretta. Una buona pratica è preparare l'importo esatto di cui avrai bisogno.
Se conservate in frigorifero, lasciare che le piastre si riscaldino prima dell'uso.
Il pH del terreno deve essere compreso tra 7,2 e 7,6 e il colore del terreno preparato è rosa pallido.
Variante di agar M-Endo
Esiste un'altra versione di Endo agar (m-Endo) che segue la formula di McCarthy, Delaney e Grasso, che contiene più composti e varia nella forma della preparazione.
Questa variante contiene: lattosio, triptosio, digestione enzimatica della caseina, digestione enzimatica del tessuto animale, cloruro di sodio, fosfato di potassio bibasico, solfito di sodio, estratto di lievito, fosfato di potassio monobasico, fucsina basica, desossicolato di sodio, laurilsolfato sodio e agar.
In questo caso, 51 g del mezzo disidratato vengono pesati e sospesi in 1 litro di acqua distillata contenente 20 ml di etanolo.
Riscaldare leggermente mescolando fino a quando il terreno si dissolve completamente. Non dovrebbe essere surriscaldato e non dovrebbe essere autoclavato. Una volta che il composto è omogeneo, servire in piastre Petri sterili e lasciare solidificare.
Uso
In alcuni paesi, è ancora utilizzato per contare i coliformi totali e fecali nei campioni di cibo e acqua, in particolare la presenza di Escherichia coli come principale indicatore di contaminazione fecale.
M-Endo Agar è raccomandato dall'American Public Health Association (APHA) per il monitoraggio e il controllo dei programmi di disinfezione e trattamento delle acque reflue, nonché per la valutazione della qualità dell'acqua potabile.
Il metodo più utilizzato è la filtrazione su membrana, dopo aver arricchito il campione con brodo laurilsolfato per 2-4 ore.
Può anche essere utilizzato come sostituto dell'agar EMB nell'analisi microbiologica di cibo e acqua mediante la tecnica del numero più probabile (MPN), in particolare nella fase di conferma completa per confermare la presenza di E. coli da brodi CE torbidi.
QA
I ceppi di controllo noti o certificati vengono seminati per valutare la qualità del lotto di agar Endo preparato.
Tra i ceppi che possono essere utilizzati a questo scopo ci sono: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 11775, Enterobacter cloacae ATCC 13047, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Shigella flexneri ATCC 12022, Proteus miracaliscus ATCC 1173CC 1173CC .
I ceppi vengono seminati per esaurimento e incubati a 37 ° C per 24 ore in aerobiosi.
I risultati attesi sono:
- Per Escherichia coli: colonie rosse forti, con lucentezza metallica.
- Per E. cloacae e K. pneumoniae le colonie devono essere mucoidi rosa.
- Nel caso di S. typhimurium, S. flexneri e P. mirabilis, le colonie sono generalmente rosa pallido o incolori.
- Infine, si prevede che E. faecalis sia parzialmente inibito, quindi la sua crescita deve essere scarsa con colonie rosa molto piccole e forti.
limitazioni
-Endo il terreno ha un basso potere selettivo, quindi è possibile che possano crescere alcuni microrganismi Gram positivi come Staphylococcus, Enterococcus e anche lieviti.
-Altri bacilli non appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae possono svilupparsi in questo terreno, come Pseudomonas sp e Aeromonas sp. Le caratteristiche di questi ceppi sono colonie irregolari incolori.
-Questo mezzo preparato è molto sensibile alla luce, pertanto, l'esposizione prolungata ad esso deteriora il sistema di indicatori, danneggiando irreversibilmente il mezzo.
-I componenti del terreno sono considerati cancerogeni, quindi il contatto diretto dovrebbe essere evitato.
-Il terreno disidratato è molto igroscopico e deve essere conservato nel suo contenitore originale a temperatura ambiente, ben chiuso e in un ambiente asciutto.
Riferimenti
- BD Laboratories. Endo Agar. 2013, disponibile su: bd.com
- Neogen Laboratories. M Endo Agar. Disponibile su: foodsafety.neogen.com
- Endo Agar. Wikipedia, l'enciclopedia libera. 7 settembre 2017, 08:27 UTC. 28 febbraio 2019, 22:55. Disponibile su: en.wikipedia.
- MercK Laboratory. Endo agar. Disponibile su: merckmillipore.com
- Scheda Tecnica Laboratori. M –Endo Agar LES. 2015, disponibile su: liofilchem.net