PERLE DI AGAR STANDARD: LOGICA, PREPARAZIONE E USI - BIOLOGIA - 2024

L' agar di conteggio standard è un terreno di coltura solido e non selettivo, progettato per la quantificazione del carico microbico aerobico presente in campioni di acqua potabile, acque reflue, bevande a base di latte e altri alimenti. Questo terreno è anche noto come PCA agar, per il suo acronimo in English Plate Count Agar. È stato creato nel 1953 da Buchbinder, Baris e Goldstein.

Il terreno agar conteggio standard è composto da estratto di lievito, triptein, glucosio, agar e acqua distillata. Questa formulazione contiene elementi nutritivi di base che consentono lo sviluppo della carica microbica aerobica presente, non impegnativa.

Diluizioni decimali per il conteggio delle CFU nei conteggi di agar standard. Fonte: Quentin Geissmann

Poiché il terreno non contiene inibitori, i batteri possono crescere senza restrizioni, rendendolo ideale per il conteggio generale delle colonie. Tuttavia, la tecnica di quantificazione della placca non rileverà tutti i batteri presenti, ma solo quelli che sono in grado di crescere nelle condizioni ambientali a cui è sottoposto l'agar conteggio standard seminato.

In questo senso, la tecnica di quantificazione su piastra cerca generalmente di determinare la quantità di batteri di tipo mesofilo aerobico, cioè quelli che crescono a temperature comprese tra 25 e 40 ° C, con una temperatura di crescita ottimale di 37 ° C. .

Questo gruppo batterico è molto importante, perché la maggior parte dei batteri patogeni per l'uomo si trova lì.

Va notato che a volte può essere interessante quantificare la quantità di batteri psicrofili presenti nel cibo. Questi batteri sono quelli che crescono a basse temperature (<20 ° C) e sono responsabili della rapida decomposizione del cibo, anche se refrigerato.

Allo stesso modo, i batteri termofili, che si sviluppano in un intervallo compreso tra 50 ° C e 80 ° C o più, possono essere importanti in alcuni tipi di alimenti come i cibi in scatola.

La quantificazione microbica è espressa in unità formanti colonie (CFU) per grammo o millilitro di campione.

Base

Il terreno di conteggio standard è progettato per consentire la crescita efficace di batteri aerobi non esigenti poiché l'estratto di lievito, il triptein e il glucosio forniscono i nutrienti necessari per una buona crescita microbica.

D'altra parte, il terreno ha un colore chiaro e un aspetto trasparente, motivo per cui è ideale per la visualizzazione delle colonie sviluppate dal metodo di semina profonda (plate pouring).

È anche possibile il conteggio delle colonie con il metodo di semina superficiale della spatola Drigalski.

Quando la carica microbica è elevata, devono essere effettuate diluizioni decimali del campione di studio per poter contare le CFU.

Va notato che questo terreno è raccomandato dall'American Public Health Association (APHA) per il conteggio dei mesofili aerobici.

Preparazione

Pesare 23,5 g del terreno disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Per dissolversi completamente, la miscela deve essere riscaldata mescolando frequentemente fino a quando non bolle. I passaggi successivi dipendono dalla tecnica di semina da utilizzare.

Per la tecnica pour-plate

Distribuire erogando da 12 a 15 ml nelle provette. Successivamente sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Lasciar solidificare verticalmente a forma di blocco. Conservare in frigorifero fino al momento dell'uso.

Sciogli la spina quando la userai. Una volta sciolto, tenerlo a bagnomaria a 44-47 ° C durante la preparazione dei campioni.

Per semina in superficie

Sterilizzare il terreno in un'autoclave a 121 ° C e quindi distribuire 20 ml in piastre Petri sterili. Lasciar solidificare, capovolgere e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso.

Temperare le piastre prima dell'uso. Il pH del mezzo dovrebbe essere 7,0 ± 0,2.

Uso

Standard Count Agar viene utilizzato nella tecnica di conteggio mesofilo aerobico durante l'analisi microbiologica di acqua e cibo. Il conteggio dei mesofili aerobici è necessario, poiché determina la qualità sanitaria del campione in esame.

L'applicazione di questa tecnica (utilizzando questo terreno) consente la visualizzazione macroscopica di colonie isolate per la loro quantificazione.

Tecnica Plate pour (semina in profondità)

-Processi

La tecnica consiste di quanto segue:

1) Omogeneizzare il campione per ridistribuire i batteri presenti.

2) Si prepara una prima sospensione in flacone o sacca sterile, rispettando il rapporto di 10 gr o 10 ml di campione in 90 ml di diluente ( ^10-1 ).

3) Dalla sospensione iniziale si effettuano le opportune diluizioni decimali a seconda del tipo di campione. Es: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Le diluizioni vengono effettuate con acqua peptone o tampone fosfato.

Per fare ciò, prelevare 1 ml della sospensione iniziale e immergerlo in 9 ml di diluente, continuare le diluizioni se necessario, prelevando ora 1 ml della diluizione ^10-2 e così via.

4) Prendere 1 ml di ciascuna diluizione e collocare in piastre Petri sterili vuote.

5) Aggiungere a ciascuna piastra da 12 a 15 ml di agar standard di conteggio precedentemente sciolto e depositato a 44 - 47 ° C.

6) Ruotare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente il campione lungo l'agar e lasciarlo solidificare.

7) Capovolgere le piastre e incubare a 37 ° C in aerobiosi per 24-48 ore.

8) Al termine del tempo si esaminano le piastre e si contano le colonie nella diluizione che lo consente. Vengono scelte per il conteggio quelle piastre che hanno da 30 a 300 CFU.

Il conteggio può essere eseguito manualmente oppure è possibile utilizzare l'attrezzatura del contatore di colonie.

I valori consentiti per ml di campione possono variare da un paese all'altro a seconda delle normative che li disciplinano.

-Calcolo di UFC

Il calcolo generale viene eseguito utilizzando la seguente formula:

Formula per il calcolo generale della quantificazione dei CFU. Fonte: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Analisi microbiologica degli alimenti, metodologia analitica ufficiale, microrganismi indicatori. 2014 Volume 3. Disponibile su: anmat.gov.ar

Esprimi i risultati in 1 o 2 cifre, moltiplicando per la base appropriata 10. Esempio: se il risultato è 16.545, viene arrotondato in base alla terza cifra a 17.000 e sarà espresso come segue: 1,7 x 10 ⁴ . Ora, se il risultato fosse 16.436, arrotondalo a 16.000 ed esprimi 1,6 x 10 ⁴ .

Tecnica di semina superficiale

-Processi

-Inocular con 0,1 ml del campione diretto se è liquido, sospensione iniziale 10 ^-1 o delle diluizioni successive 10 ^-2 , 10 ^-3 ecc, al centro di una piastra di agar conteggio standard.

-Distribuire il campione uniformemente con una spatola Drigalski o una bacchetta di vetro a forma di L. Lasciar riposare per 10 minuti.

-Invertire le piastre e incubare in aerobiosi a 37 ° C per 24-48 ore.

-Procedere al conteggio delle colonie, scegliere quelle piastre che sono in un range compreso tra 20 e 250 CFU.

-Calcolo di UFC

Per il calcolo viene applicato il fattore di diluizione, che è l'inverso. Il numero è arrotondato a 2 cifre significative (arrotondamento in base alla terza cifra) ed è espresso in potenza di base 10. Ad esempio, se nel campione si contano 224 CFU senza diluizione ( ^10-1 ), viene riportato 22 x 10 ¹ CFU , ma se il dato fosse 225, si riporta 23 x 10 ¹ CFU.

Ora, se vengono contati 199 CFU nella diluizione 10 ^-3 , verranno riportati 20 x 10 ⁴ CFU, ma se vengono contati 153 CFU nella stessa diluizione, verranno riportati 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Il terreno di coltura standard può essere valutato utilizzando ceppi certificati noti, come: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Se il terreno di coltura è in condizioni ottimali, si prevede una crescita soddisfacente in tutti i casi, ad eccezione di L. fermentum, che può avere una resa regolare.

Per valutare la sterilità del terreno di coltura, incubare una o due piastre di ciascun lotto preparato (senza inoculo) a 37 ° C in aerobiosi per 24 ore. Trascorso questo tempo, non si dovrebbe osservare alcuna crescita o cambiamento di colore nel terreno.

limitazioni

-Non sciogliere l'agar più di una volta.

-Il terreno preparato può durare fino a 3 mesi purché conservato in frigorifero e protetto dalla luce.

-Questo terreno non è adatto per microrganismi esigenti o anaerobici.

Riferimenti

1. Amministrazione nazionale dei medicinali, degli alimenti e della tecnologia medica (ANMAT). Analisi microbiologica degli alimenti, metodologia analitica ufficiale, microrganismi indicatori. 2014 Volume 3. Disponibile su: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. Disponibile su: http://f-soria.es
3. Laboratori Conda Pronadisa. Standard Method Agar (PCA) secondo APHA e ISO 4833. Disponibile su: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Conteggio su piastra di agar. 2015 Disponibile su: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Tecniche per l'analisi microbiologica degli alimenti. 2a ed. Facoltà di Chimica, UNAM. Messico. Disponibile su: depa.fquim.unam