DNA MICROARRAYS: PROCEDURA E APPLICAZIONI - BIOLOGIA - 2025

Un microarray di DNA , chiamato anche chip di DNA o microarray di DNA, è composto da una serie di frammenti di DNA ancorati a un supporto fisico di materiale variabile, plastica o vetro. Ogni pezzo di DNA rappresenta una sequenza complementare a un gene specifico.

L'obiettivo principale dei microarrays è lo studio comparativo dell'espressione di alcuni geni di interesse. Ad esempio, è comune che questa tecnica venga applicata a due campioni - uno in condizioni di salute e uno patologico - al fine di identificare quali geni vengono espressi e quali non sono nel campione con la condizione. Detto campione può essere una cellula o un tessuto.

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Generalmente l'espressione dei geni può essere rilevata e quantificata grazie all'utilizzo di molecole fluorescenti. La manipolazione dei chip viene eseguita nella maggior parte dei casi da robot e un gran numero di geni può essere analizzato contemporaneamente.

Questa nuova tecnologia è utile per un'ampia gamma di discipline, dalla diagnostica medica a vari studi di biologia molecolare nei campi della proteomica e della genomica.

In cosa consiste?

I microarray di DNA (acido desossiribonucleico) sono un insieme di segmenti di DNA specifici attaccati a una matrice solida. Queste sequenze sono complementari ai geni che si vogliono studiare e possono esserci fino a 10.000 geni per cm ² .

Queste caratteristiche consentono lo studio sistematico e massiccio dell'espressione genica di un organismo.

Le informazioni di cui una cellula ha bisogno per funzionare sono codificate in unità chiamate "geni". Alcuni geni contengono le istruzioni per creare molecole biologiche essenziali chiamate proteine.

Un gene viene espresso se il suo DNA viene trascritto in una molecola di RNA messaggero intermedio e l'espressione del gene può variare a seconda del livello di trascrizione di questo segmento di DNA. In alcuni casi, il cambiamento di espressione può essere indicativo di malattie.

Il principio di ibridazione rende possibile il funzionamento dei microarrays. Il DNA è una molecola composta da quattro tipi di nucleotidi: adenina, timina, guanina e citosina.

Per formare la struttura a doppia elica, l'adenina si raggruppa con la timina e la citosina con la guanina. Pertanto, due catene complementari possono essere unite da legami idrogeno.

Tipi di microarrays

In termini di struttura dei microarray, ci sono due variazioni: il DNA complementare personalizzato o composti oligonucleotidici e i microarray commerciali ad alta densità prodotti da società commerciali, come Affymetrix GeneChip.

Il primo tipo di microarray permette l'analisi di RNA da due diversi campioni su un unico chip, mentre la seconda variazione è di tipo commerciale e ha un gran numero di geni (ad esempio, l'Affymetrix GeneChip ha circa 12.000 geni umani) permettendo di analizzare un singolo campione.

Processi

Isolamento dell'RNA

Il primo passo nella conduzione di un esperimento utilizzando la tecnologia microarray è l'isolamento e la purificazione delle molecole di RNA (può essere RNA messaggero o altri tipi di RNA).

Se si desidera confrontare due campioni (sano vs malato, controllo vs trattamento, tra gli altri), è necessario eseguire l'isolamento della molecola in entrambi i tessuti.

Produzione ed etichettatura di cDNA

Successivamente, l'RNA viene sottoposto ad un processo di trascrizione inversa in presenza di nucleotidi marcati e si otterrà così il DNA o cDNA complementare.

L'etichetta può essere fluorescente e deve essere distinguibile tra i due tessuti da analizzare. In modo tradizionale vengono utilizzati i composti fluorescenti Cy3 e Cy5, poiché emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda. Nel caso di Cy3, è un colore vicino al rosso e Cy5 corrisponde allo spettro tra arancio e giallo.

ibridazione

I cDNA vengono miscelati e incubati nel microarray di DNA per consentire l'ibridazione (cioè, avviene il legame) del cDNA da entrambi i campioni con la porzione di DNA immobilizzata sulla superficie solida del microarray.

Una percentuale più alta di ibridazione con la sonda nel microarray viene interpretata come una maggiore espressione tissutale del corrispondente mRNA.

Lettura del sistema

La quantificazione dell'espressione viene effettuata incorporando un sistema di lettura che assegna un codice colore alla quantità di fluorescenza emessa da ciascun cDNA. Ad esempio, se il rosso è utilizzato per contrassegnare la condizione patologica e si ibrida in una proporzione maggiore, la componente rossa sarà quella predominante.

Con questo sistema è possibile conoscere la sovraespressione o la repressione di ciascun gene analizzato in entrambe le condizioni selezionate. In altre parole, si può conoscere il trascrittoma dei campioni valutati nell'esperimento.

Larssono, da Wikimedia Commons

applicazioni

Attualmente, i microarray sono considerati strumenti molto potenti in campo medico. Questa nuova tecnologia consente la diagnosi di malattie e una migliore comprensione di come l'espressione genica viene modificata in diverse condizioni mediche.

Inoltre, consente il confronto tra un tessuto di controllo e un tessuto trattato con un determinato farmaco, al fine di studiare gli effetti di un possibile trattamento medico.

Per fare ciò, lo stato normale e lo stato di malattia vengono confrontati prima e dopo la somministrazione del farmaco. Studiando l'effetto del farmaco sul genoma in vivo, abbiamo una migliore panoramica del suo meccanismo d'azione. Inoltre, si può capire perché alcuni farmaci particolari portano a effetti collaterali indesiderati.

Cancro

Il cancro è in cima alla lista delle malattie studiate con DNA microarrays. Questa metodologia è stata utilizzata per la classificazione e la prognosi della malattia, in particolare nei casi di leucemie.

Il campo di ricerca di questa condizione coinvolge la compressione e la caratterizzazione delle basi molecolari delle cellule tumorali per trovare modelli di espressione genica che si traducono in fallimenti nella regolazione del ciclo cellulare e nei processi di morte cellulare (o apoptosi).

Altre malattie

Attraverso l'utilizzo di microarrays è stato possibile chiarire i profili di espressione differenziale dei geni in condizioni mediche di allergie, immunodeficienze primarie, malattie autoimmuni (come l'artrite reumatoide) e malattie infettive.

Riferimenti

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