IMMUNOFLUORESCENZA: RAZIONALE, PROTOCOLLO E APPLICAZIONI - BIOLOGIA - 2025

L' immunofluorescenza è una potente tecnica di immunocolorazione che utilizza anticorpi legati in modo covalente a molecole fluorescenti per identificare bersagli specifici in campioni cellulari fissati su un supporto solido.

Questa tecnica prevede l'osservazione microscopica con specificità immunologica, che consente di osservare cellule vive o morte che possono presentare quantità minuscole di antigeni. Trova largo impiego sia nel campo della ricerca che nella diagnosi clinica di varie patologie.

Immunomarcatura dei filamenti di actina nelle cellule cardiomiocitiche (Fonte: Ps1415 tramite Wikimedia Commons)

Questa tecnica, principalmente qualitativa (con alcune varianti quantitative), ha a che fare specificamente con la visualizzazione di un campione dal segnale del prodotto di un fluoroforo, che è una molecola fluorescente legata ad un anticorpo e che è in grado di essere eccitato ad una certa lunghezza d'onda .

In ambito cellulare è molto utile studiare la presenza / assenza e la localizzazione subcellulare delle proteine. La tecnica è stata inizialmente utilizzata in ambito clinico per la diagnosi di virus come l'influenza e successivamente per molte altre malattie infettive.

È una tecnica altamente sensibile e, con l'attrezzatura di microscopia appropriata, può avere una risoluzione molto buona. Richiede, per la sua osservazione, l'uso di microscopi confocali o ad epifluorescenza.

Tuttavia, pur essendo molto diffuso, può presentare alcuni importanti problemi rispetto all'ottenimento di fluorescenze aspecifiche che generano del “rumore” di fondo, che spesso limita l'adeguata lettura dei risultati.

Base

L'immunofluorescenza si basa sullo sfruttamento del fenomeno biologico della reazione di interazione tra un anticorpo e un antigene. Ha a che fare specificamente con la visualizzazione o il rilevamento di questa reazione eccitando le molecole fluorescenti a una lunghezza d'onda specifica.

Un anticorpo è una proteina immunoglobulinica secreta dai linfociti B attivi, che viene generata specificamente contro un antigene, al quale può legarsi con grande affinità e specificità. L'immunofluorescenza fa uso di immunoglobuline IgG, che si trovano solubili nel siero del sangue.

Gli anticorpi sono molecole fino a 950 kDa costituite da due catene peptidiche corte (leggere) e due lunghe a forma di "Y" (pesanti). Sia la catena leggera che quella pesante sono divise in due domini: una variabile, in grado di riconoscere l'antigene, e un'altra costante o conservata, caratteristica di ciascuna specie.

Gli antigeni sono definiti funzionalmente come molecole che possono essere riconosciute da un anticorpo e sono, per la maggior parte, proteine. Quando un animale viene esposto a un antigene, i linfociti del sistema immunitario si attivano producendo anticorpi specifici contro di esso e che funzionano come un sistema di difesa.

Un antigene, come una proteina, per esempio, può avere più di un epitopo o sito di riconoscimento da parte di un anticorpo, quindi il siero dell'animale esposto a un antigene può avere anticorpi policlonali contro diverse regioni della stessa proteina.

L'immunofluorescenza, quindi, sfrutta la capacità di un animale di produrre anticorpi policlonali contro uno specifico antigene al fine di purificarlo e successivamente utilizzarlo per la rilevazione dello stesso antigene in altri contesti.

Tra i coloranti o molecole fluorescenti più utilizzati per alcune tecniche di immunofluorescenza ci sono isotiocianato di fluoresceina (FITC), isotiocianato di tetrametilrodamina-5 e 6 (TRITC), molte cianine come Cy2, Cy3, Cy5 e Cy7 e coloranti chiamati Alexa Fluor® , come Alexa Fluor®448.

Protocollo

Il protocollo di immunofluorescenza varia a seconda di molti fattori, tuttavia, in termini generali, comprende una sequenza lineare di passaggi composta da:

• Preparazione delle piastre e delle celle
• Fissazione dei campioni
• permeabilizzazione
• Blocco
• Immunocolorazione o immunocolorazione
• Assemblaggio e osservazione

-Preparazione

Dei campioni

La preparazione dei campioni dipenderà dalla loro natura e dal tipo di esperienza da svolgere. Di seguito verrà spiegato il caso più semplice, che prevede l'utilizzo di cellule in sospensione.

Le cellule in sospensione, cioè in un mezzo di coltura liquido, devono essere prima separate da esso mediante centrifugazione e poi devono essere lavate con una soluzione tampone o "tampone" isosmotico, che ne preserva l'integrità.

Normalmente viene utilizzato un tampone fosfato-salino noto come PBS, in cui le cellule vengono risospese e questa miscela viene nuovamente centrifugata per ottenere le cellule libere dal mezzo di coltura, che può contenere sostanze interferenti.

Delle lame

Anche i vetrini utilizzati per l'osservazione microscopica, dove verranno successivamente fissate le cellule per i corrispondenti trattamenti a valle, devono essere preparati con cura.

Questi vengono ricoperti o "sensibilizzati" con una soluzione di polilisina, un polimero sintetico che fungerà da "collante molecolare" tra le cellule e il supporto solido, grazie all'interazione elettrostatica tra le cariche positive dei loro gruppi amminici e il cariche negative sulle proteine ​​che rivestono le cellule.

Fissazione dei campioni

Questo processo consiste nell'immobilizzare le proteine ​​che si trovano all'interno della cellula per mantenere intatta la loro posizione spaziale. Le molecole utilizzate devono essere in grado di attraversare tutti i tipi di membrane cellulari e formare reticoli con le proteine ​​covalenti.

Sono ampiamente utilizzati formaldeide e paraformaldeide, glutaraldeide e anche metanolo, con cui i campioni cellulari vengono incubati per un certo tempo e poi lavati con una soluzione tampone isosmotica.

Dopo aver fissato le cellule, continuano ad essere attaccate ai fogli precedentemente sensibilizzati con polilisina.

permeabilizzazione

A seconda del tipo di test che viene eseguito, sarà necessario permeabilizzare o meno le cellule in esame. Se ciò che si cerca è conoscere la posizione, la presenza o l'assenza di una certa proteina sulla superficie cellulare, la permeabilizzazione non sarà necessaria.

Se invece si vuole conoscere la posizione di una proteina all'interno della cellula, la permeabilizzazione è fondamentale e consisterà nell'incubare i campioni con Triton X-100, un detergente in grado di permeabilizzare le membrane cellulari.

Blocco

Un passaggio fondamentale in tutte le tecniche immunologiche è il blocco. In questa fase della procedura, il blocco consiste nel ricoprire, sui fogli sensibilizzati, tutti i siti con molecole di polilisina a cui le cellule non hanno aderito. Cioè, impedisce qualsiasi unione aspecifica.

Normalmente le soluzioni con albumina di siero bovino (BSA) in tampone PBS vengono utilizzate per il blocco e i migliori risultati si ottengono più lungo è il tempo di incubazione con questa soluzione. Dopo ogni passaggio, compreso il blocco, è necessario lavare via la soluzione rimanente.

Immunocolorazione o immunocolorazione

La procedura di immunocolorazione o immunocolorazione dipenderà principalmente dal fatto che si tratti di un'immunofluorescenza diretta o indiretta (vedi sotto).

Se si tratta di immunofluorescenza primaria o diretta, i campioni verranno incubati con gli anticorpi desiderati, che dovranno essere accoppiati ai coloranti fluorescenti. La procedura di incubazione consiste nel fare una diluizione dell'anticorpo in una soluzione che conterrà anche BSA ma in proporzione inferiore.

Quando il caso è quello di un'immunofluorescenza secondaria o indiretta, devono essere eseguite due incubazioni consecutive. Prima con gli anticorpi desiderati e poi con gli anticorpi che sono in grado di rilevare le regioni costanti delle immunoglobuline primarie. Sono questi anticorpi secondari che sono legati covalentemente ai fluorofori.

La tecnica è molto versatile, consentendo l'etichettatura simultanea di più di un antigene per campione, purché vi siano anticorpi primari accoppiati a diversi fluorofori, nel caso di immunofluorescenza diretta.

Per l'etichettatura simultanea nell'immunofluorescenza indiretta, è necessario garantire che ogni anticorpo primario sia prodotto in un animale diverso, nonché che ogni anticorpo secondario sia accoppiato a un fluoroforo diverso.

Come il blocco, l'incubazione con gli anticorpi dà risultati migliori quanto più lungo è il tempo di questo. Dopo ogni passaggio, è necessario lavare via gli anticorpi in eccesso che non si sono legati ai campioni e nell'immunofluorescenza secondaria è necessario bloccare prima di aggiungere l'anticorpo secondario.

Alcune tecniche utilizzano altri coloranti non correlati all'immunocolorazione, come la colorazione del DNA nucleare con il fluoroforo DAPI.

Assemblaggio e osservazione

Durante il tempo di incubazione finale con i fluorofori è necessario che i campioni rimangano al buio. Per l'osservazione al microscopio, è comune utilizzare alcune sostanze per preservare la fluorescenza dei fluorofori accoppiati agli anticorpi.

tipi

Riepilogo grafico dell'immunofluorescenza diretta e indiretta (Fonte: Westhayl618 tramite Wikimedia Commons)

Immunofluorescenza diretta o primaria

Ha a che fare con la rilevazione di antigeni attraverso l'uso di anticorpi fluorescenti. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica è la sua velocità, tuttavia, possono verificarsi molti casi di legame aspecifico nel processo, in particolare quando si studiano sieri umani, poiché sono ricchi di anticorpi altamente eterogenei.

Immunofluorescenza indiretta o secondaria

È anche nota come tecnica "sandwich" e ciò comporta lo sviluppo della tecnica in due fasi. Il primo ha a che fare con l'uso di un anticorpo non fluorescente e il suo legame con l'antigene di interesse.

Contro la regione costante di questo primo anticorpo (che ora servirà da antigene) viene utilizzato un secondo anticorpo in grado di riconoscerlo, associato a una molecola fluorescente.

La comparsa di un segnale fluorescente sarà il risultato del riconoscimento specifico tra il primo anticorpo non fluorescente e l'antigene di interesse; la presenza di questo primo anticorpo condiziona quella del secondo, che viene marcato e grazie al quale è possibile determinare la presenza o l'assenza dell'antigene.

Nonostante sia una tecnica molto più dispendiosa in termini di tempo rispetto all'immunofluorescenza diretta (poiché include un'ulteriore fase di incubazione), questa tecnica non prevede la progettazione di un anticorpo fluorescente per ciascun antigene studiato, il che si traduce, in termini economici, più praticabile.

Inoltre, è una tecnica più sensibile in termini di amplificazione del segnale, poiché più di un anticorpo secondario può legarsi alla regione costante dell'anticorpo primario, amplificando così l'intensità del segnale fluorescente.

applicazioni

Come è stato notato in precedenza, l'immunofluorescenza è una tecnica estremamente versatile, che è stata utilizzata in molti modi in campo scientifico e clinico. Può essere utilizzato per rispondere a domande ecologiche, genetiche e fisiologiche riguardanti molti organismi.

Tra le applicazioni cliniche, viene utilizzato per la diagnosi diretta di alcune malattie dermatologiche, utilizzando l'immunofluorescenza diretta o indiretta sul tessuto epiteliale dei pazienti studiati.

Le tecniche di immunofluorescenza sono state disponibili in organismi unicellulari come il lievito per visualizzare microtubuli intranucleari e citoplasmatici, actina e proteine ​​associate, filamenti a 10 nm e altri costituenti del citoplasma, della membrana e delle pareti cellulari.

Riferimenti

1. Abcam, Immunocitochimica e protocollo di immunofluorescenza. Estratto da abcam.com
2. Greph, C. (2012). Coloranti fluorescenti. Estratto da leica-microsystems.com
3. Miller, DM e Shakest, DC (1995). Microscopia a immunofluorescenza. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID e Cook, D. (2013). Tecniche di immunofluorescenza. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG e Brian, K. (1991). Metodi di immunofluorescenza per lievito. In Methods of Enzymology (Vol. 194, pp. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V e Widelock, D. (1964). Applicazioni dell'immunofluorescenza nella virologia della sanità pubblica. Recensioni batteriologiche, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG e Anderson, DM (1996). Immunofluorescenza nella ricerca sul fitoplancton: applicazioni e potenzialità. J: Phycol. , 32, 1–16.