ISTOCHIMICA: RAZIONALE, ELABORAZIONE, COLORAZIONE - BIOLOGIA - 2025

L' istochimica è uno strumento utile nello studio della morfologia di vari tessuti biologici (piante e animali) grazie al suo principio di reazione dei componenti del tessuto come carboidrati, lipidi e proteine, tra gli altri, coloranti chimici.

Questo prezioso strumento consente non solo di identificare la composizione e la struttura di tessuti e cellule, ma anche le varie reazioni che si verificano in essi. Allo stesso modo, si possono evidenziare possibili danni ai tessuti causati dalla presenza di microrganismi o altre patologie.

Macchie istochimiche. Virus del Nilo, batteri Gram positivi e Gram negativi (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Fonte: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

L'istochimica, dei secoli passati, ha fornito importanti contributi, come la dimostrazione dell'esistenza della barriera emato-encefalica di Paul Ehrlich. Ciò è stato possibile perché il cervello dell'animale sperimentale utilizzato da Ehrlich non era macchiato di anilina, che è un colorante di base.

Ciò ha portato all'uso di vari coloranti come il blu di metilene e l'indofenolo, al fine di colorare i diversi tipi di cellule. Questa scoperta ha portato alla classificazione delle cellule in acidofile, basofile e neutrofile, in base alla loro specifica colorazione.

Recenti studi hanno applicato questa tecnica per dimostrare la presenza di vari composti, tra cui fenoli, ma anche carboidrati e lipidi non strutturali, nei tessuti della specie Litsea glaucescens, meglio conosciuta come lauro. Trovandoli, sia nella foglia che nel legno.

Allo stesso modo, Colares et al, 2016, hanno identificato la pianta di interesse medicinale Tarenaya hassleriana, utilizzando tecniche istochimiche. In questa specie è stata evidenziata la presenza di amido, mirosina, nonché composti fenolici e lipofili.

Base

L'istochimica si basa sulla colorazione di strutture o molecole cellulari presenti nei tessuti, grazie alla loro affinità con coloranti specifici. La reazione di colorazione di queste strutture o molecole nel loro formato originale, viene successivamente visualizzata al microscopio ottico o al microscopio elettronico.

La specificità della colorazione è dovuta alla presenza di gruppi che accettano gli ioni presenti nelle cellule o nelle molecole di tessuto.

Infine, l'obiettivo delle reazioni istochimiche è quello di poterlo mostrare attraverso la colorazione. Dalle più grandi strutture biologiche al più piccolo dei tessuti e delle cellule. Ciò può essere ottenuto grazie al fatto che i coloranti reagiscono chimicamente con le molecole dei tessuti, delle cellule o degli organelli.

Accusa

La reazione istochimica potrebbe comportare passaggi prima di eseguire la tecnica, come la fissazione, l'inclusione e il taglio del tessuto. Si deve quindi tenere conto che in queste fasi la struttura da identificare può essere danneggiata, dando risultati falsi negativi, anche se presente.

Nonostante ciò, è importante la fissazione preventiva del tessuto eseguita correttamente, poiché impedisce l'autolisi o la distruzione cellulare. Per questo, le reazioni chimiche vengono utilizzate con solventi organici come: formaldeide o glutaraldeide, tra gli altri.

L'inclusione del tessuto è fatto in modo che mantenga la sua fermezza durante il taglio e quindi ne prevenga la deformazione. Infine si esegue il taglio con un microtomo per lo studio dei campioni mediante microscopia ottica.

Inoltre, prima di procedere con la colorazione istochimica, si consiglia di incorporare controlli positivi esterni o interni in ogni lotto di test. Così come l'uso di coloranti specifici per le strutture da studiare.

Macchie istochimiche

Dall'emergere delle tecniche istochimiche ad oggi, è stata utilizzata un'ampia gamma di coloranti, compresi quelli più frequentemente utilizzati come: Periodic acid Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen e Gram.

Allo stesso modo, altri coloranti sono stati usati meno frequentemente come inchiostro di India, orceina o macchia tricromica di Masson, tra gli altri.

Periodic Acid Schiff (PAS)

Con questa colorazione si possono osservare molecole ad alto contenuto di carboidrati, come: glicogeno e mucina. Tuttavia, è anche utile per l'identificazione di microrganismi come funghi e parassiti. Oltre a determinate strutture (membrana basale) nella pelle e in altri tessuti.

La base per questa colorazione è che il colorante ossida i legami di carbonio tra due gruppi idrossilici vicini. Questo produce il rilascio del gruppo aldeidico e questo viene rilevato dal reagente di Schiff, dando un colore viola.

Il reagente di Schiff è composto da fuchsina basica, metabisolfito di sodio e acido cloridrico, questi componenti responsabili della colorazione viola, quando sono presenti gruppi aldeidici. Altrimenti viene generato un acido incolore.

L'intensità della colorazione dipenderà dalla quantità di gruppi idrossilici presenti nei monosaccaridi. Ad esempio, nei funghi, nelle membrane basali, nelle mucine e nel glicogeno il colore può andare dal rosso al viola, mentre i nuclei si colorano di blu.

Grocott

È una delle macchie con la più alta sensibilità nell'identificazione di funghi nei tessuti inclusi in paraffina. Ciò consente l'identificazione delle varie strutture fungine: ife, spore, endospore, tra gli altri. Pertanto, è considerata una macchia di routine per la diagnosi di micosi.

È particolarmente utilizzato nella diagnosi di micosi polmonari come pneumocistosi e aspergillosi causate rispettivamente da alcuni funghi dei generi Pneumocystis e Aspergillus.

Questa soluzione contiene nitrato d'argento e acido cromico, quest'ultimo essendo un fissativo e colorante. La logica è che questo acido produce l'ossidazione dei gruppi idrossilici ad aldeidi da parte dei mucopoliacaridi presenti nelle strutture fungine, ad esempio nella parete cellulare dei funghi.

Infine, l'argento presente nella soluzione viene ossidato dalle aldeidi, provocando una colorazione nera, chiamata reazione argentafin. Possono essere utilizzati anche coloranti a contrasto come il verde chiaro e quindi le strutture fungine saranno osservate in nero con uno sfondo verde chiaro.

Ziehl-Neelsen

Questa colorazione si basa sulla presenza di resistenza acido-alcol, parziale o totale, in alcuni microrganismi come i generi Nocardia, Legionella e Mycobacterium.

Si consiglia l'uso di questo colorante, perché la parete cellulare dei microrganismi precedentemente citati contiene lipidi complessi che ostacolano la penetrazione dei coloranti. Soprattutto nei campioni delle vie respiratorie.

In esso vengono utilizzati coloranti forti come il carbol fuchsin (colorante di base) e viene applicato calore in modo che il microrganismo possa trattenere il colorante e non scolorisca con acidi e alcoli. Infine, viene applicata una soluzione di blu di metilene per colorare le strutture che si sono scolorite.

La presenza di resistenza acido-alcol è osservata nelle strutture colorate di rosso, mentre le strutture che non resistono allo sbiadimento sono colorate di blu.

Grammo e inchiostro cinese

Il Gram è un colorante molto utile nella diagnosi di infezioni batteriche e fungine, tra le altre. Questa colorazione permette di differenziare tra microrganismi Gram-positivi e Gram-negativi, mostrando chiaramente le differenze che esistono nella composizione della parete cellulare.

Mentre l'inchiostro di china è una macchia che viene utilizzata per contrastare le strutture che contengono polisaccaridi (capsula). Questo perché un anello si forma nell'ambiente, essendo possibile in Cryptococcus neoformans.

Orceina

Con questa colorazione si colorano le fibre elastiche ed i cromosomi di varie cellule, consentendo la valutazione del processo di maturazione di queste ultime. Per questo motivo è stato molto utile negli studi citogenetici.

Questo si basa sull'assorbimento del colorante da parte della carica negativa di molecole come il DNA, presenti nei nuclei di un'ampia varietà di cellule. Quindi questi sono colorati dal blu al viola scuro.

Tricromia di Masson

Questa macchia viene utilizzata per identificare alcuni microrganismi o materiali che contengono pigmenti melanici. È il caso delle micosi, causate da funghi dematiaci, feoifomicosi e nell'eumicetoma a grani neri.

Pensieri finali

Negli ultimi anni ci sono stati molti progressi nella creazione di nuove tecniche diagnostiche, in cui è coinvolta l'istochimica ma collegata ad altri fondamenti o principi. Queste tecniche hanno uno scopo diverso, come nel caso dell'immunoistochimica o dell'enzimoistochimica.

Riferimenti

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. Disponibile su: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Frequenza delle colorazioni istochimiche PAS, Grocott e Ziehl-Neelsen utilizzate per l'identificazione di microrganismi, eseguite nel Servizio di Anatomia Patologica dell'Ospedale Specialistico Eugenio Espejo nel 2015 .. Università Centrale dell'Ecuador, Quito; 2016, disponibile su: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F.Istochimica, contenuto di fenolo totale e attività antiossidante della foglia di litsea e del legno glaucescens Kunth (Lauraceae). Legno e foreste. 2014; 20 (3): 125-137. Disponibile su: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomia e istochimica di Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), una specie di interesse medicinale. Bollettino delle piante medicinali e aromatiche dell'America Latina e dei Caraibi 2016; 15 (3): 182-191. Disponibile su: redalyc.org
5. Bonifaz A. Micologia medica di base. 4a edizione. Messico: editor di McGraw-Hill Interamericana, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Analisi clinico patologica e immunoistochimica del carcinoma a cellule squamose della lingua: un caso raro. Einstein (San Paolo) 2019; 17 (1): eRC4610. Disponibile su: scielo.br