- Base
- reagenti
- Stabilità del reagente biureto
- Processi
- Tecnica
- Curva di calibrazione
- interferenza
- Sostanze che interferiscono con il test Biureto
- Sostanze che non interferiscono con il test Biureto
- Vantaggio
- svantaggi
- applicazioni
- Patologie che si verificano con un aumento o una diminuzione
- Campioni clinici
- Valore normale del rapporto proteine urinarie / creatinina urinaria
- Campioni non clinici
- Riferimenti
Il biureto è un reagente utilizzato per la determinazione delle proteine a catena lunga e corta. Viene utilizzato soprattutto nell'area della chimica analitica e dell'analisi delle urine per studiare la concentrazione delle proteine totali nel siero, plasma e urina.
I valori delle proteine possono essere aumentati o diminuiti in alcune patologie. I sintomi dell'ipoproteinemia di solito si verificano in pazienti con malattia renale, in pazienti malnutriti e in pazienti con infezioni croniche.
Struttura chimica del complesso formato nel test Biureto positivo della reazione Biureto. Fonte: Yikrazuul / flickr
Mentre l'iperproteinemia è osservata in patologie come il mieloma multiplo, il lupus eritematoso sistemico, l'endocardite batterica, la meningite batterica, la macroglobulinemia di Waldenstrom, tra gli altri.
D'altra parte, la presenza di proteine nelle urine è dovuta alla filtrazione dell'albumina da parte dei reni. Questo è un comportamento patologico che deve essere studiato.
In questo senso, il Biureto è molto utile, poiché permette di quantificare la presenza di proteine nel siero, plasma, urina, tra molti altri campioni.
Anche il Biureto può essere utilizzato per indagare la presenza e la concentrazione di proteine in campioni scarsamente esplorati o campioni di composizione sconosciuta. Pertanto, è ampiamente utilizzato nell'area della ricerca.
Il test Biuret si basa sulla rilevazione dei legami peptidici. Il test si svolge in un mezzo alcalino. Il campione deve contenere almeno due legami peptidici affinché si formi un complesso viola-porpora. Il complesso è formato dall'unione dei legami e dello ione rame.
Base
Il reagente di Biureto è composto da idrossido di potassio, solfato rameico e tartrato di sodio e potassio. L'idrossido di sodio viene utilizzato per alcalinizzare il mezzo, poiché questa condizione è essenziale affinché la reazione abbia luogo.
La sostanza che reagisce con le proteine è il solfato rameico, mentre il tartrato di sodio ha la funzione di non permettere la formazione dell'idrossido di rame, che tende a precipitare e interferisce con la reazione.
Se nel campione vengono trovate sostanze con legami peptidici (polipeptidi o proteine), il test sarà positivo.
Una reazione viene interpretata come positiva quando la soluzione diventa viola. Il colore è prodotto dalla formazione di un complesso tra almeno due legami peptidici che hanno il gruppo CO-NH e i cationi rameici.
Il complesso viola può essere formato in due modi: uno è dalla perdita di protoni dai gruppi ammidici che si legano al metallo (depronotazione), e l'altro dall'unione degli elettroni dell'ossigeno e dell'azoto che sono liberi e si legano con rame.
Questa reazione può variare in intensità e colore a seconda del tipo di proteina.
Il test può essere eseguito qualitativamente o quantitativamente. Nella forma qualitativa è riportato come positivo o negativo. Mentre nella forma quantitativa la concentrazione può essere misurata con il metodo spettrofotometrico.
La reazione viene letta tra 540-560 nm. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di legami peptidici nel campione.
reagenti
-20% idrossido di sodio (NaOH)
-Solfato rameico pentaidrato 1% (CuSO 4. 5H 2 O)
-Misto di sodio e potassio tartrato tetraidrato (KNaC 4 H 4 O 6 · 4H 2 O)
Stabilità del reagente biureto
-Deve essere conservato in frigorifero.
Processi
Tecnica
-Posizionare 100 µl di campione o standard da analizzare in una provetta.
-Aggiungere 2 ml di idrossido di sodio.
-Mescola molto bene.
-Aggiungere 5 ml di reagente Biureto.
-Mescolare e lasciare riposare per 25 minuti a temperatura ambiente, coprire e proteggere dalla luce.
-Osservare la formazione o meno del colore e misurare spettrofotometricamente.
Curva di calibrazione
L'albumina sierica bovina può essere utilizzata come standard per eseguire la curva di calibrazione. Da esso vengono preparate varie concentrazioni. Ad esempio 25, 50, 75, 100, 125 e 150%.
La reazione viene impostata con tutte queste concentrazioni note e l'assorbanza viene letta ad una lunghezza d'onda di 540 nm. Con i dati delle concentrazioni note e le letture dell'assorbanza si effettua la curva di calibrazione.
In ogni determinazione o lotto di campioni processati si consiglia di montare uno standard. L'albumina sierica bovina 0,1-2 mg / ml può essere utilizzata come standard di calibrazione.
Le misurazioni vengono effettuate su uno spettrofotometro a 540 nm.
La linearità è soddisfatta fino ad una concentrazione di 12 g / dl.
interferenza
Sostanze che interferiscono con il test Biureto
Sebbene non sia molto frequente, va notato che alcune sostanze possono interferire durante l'esecuzione di questo test. Ad esempio, la presenza di ammoniaca può inibire la formazione del colore.
Allo stesso modo, altre sostanze potrebbero assorbire alla stessa lunghezza d'onda, come alcuni pigmenti.
D'altra parte, l'interferenza può essere generata quando una sostanza diversa dal legame peptidico forma un complesso con il sale rameico. Esempio: alcuni carboidrati e alcuni lipidi.
Nel caso in cui il campione da analizzare presenti qualche tipo di precipitato, deve essere filtrato o centrifugato prima di montare il test.
Sostanze che non interferiscono con il test Biureto
Il test non è influenzato dalla presenza di:
-Bilirubina fino a una concentrazione di 20 mg / dl.
-Emoglobina fino a una concentrazione di 750 mg / dl.
-Dextran fino ad una concentrazione di 30 g / L.
-Trigliceridi fino ad una concentrazione di 4000 mg / dl.
Vantaggio
-È un metodo semplice da eseguire.
-È un test economico.
-Ha un'elevata specificità per le proteine.
-Poca interferenza.
svantaggi
Ha una scarsa sensibilità per rilevare basse quantità di proteine. Il lavoro svolto da Fuentes et al.afferma che il metodo del test Biuret ha un limite di rilevamento di 1 mg / ml di proteine e un limite di quantificazione di 3 mg / ml.
Tuttavia, altre ricerche condotte presso l'Università dell'Amazzonia riportano valori molto più bassi. Il limite di rilevamento riportato dallo studio è 0,020 mg / ml e il limite di quantificazione è 1,33 mg / ml.
applicazioni
Il reagente o test Biuret viene utilizzato per la determinazione delle proteine in campioni clinici e non clinici nei laboratori di routine e di ricerca.
Patologie che si verificano con un aumento o una diminuzione
In molte patologie è importante determinare la concentrazione di proteine totali nei campioni clinici, che può essere elevata o diminuita.
Sono elevati in:
-Mieloma multiplo,
-Lupus eritematoso sistemico,
-Endocardite batterica,
-Meningite batterica,
Macroglobulinemia di Waldenstrom, tra gli altri.
È diminuito in:
-Insufficienza renale,
-Persone con gravi gradi di malnutrizione,
-Pazienti con infezioni croniche, tra gli altri.
Campioni clinici
I campioni clinici più comuni sono siero, plasma e urina. Il valore normale delle proteine nel siero o nel plasma è 6,0-8,8 gr / dl.
La concentrazione di proteine nelle urine negli adulti non supera la cifra di 150 mg / 24 ore.
Valore normale del rapporto proteine urinarie / creatinina urinaria
Neonati: <0,50 mg
Bambini dai 2 anni in su: indice: 0,20 mg
Adulti: <0,2 mg
Campioni non clinici
La reazione Biureto può essere utilizzata per molti tipi di campioni non clinici, come latticini, antiveleno o qualsiasi sostanza sconosciuta per la quale si desidera indagare sulla presenza di proteine.
Riferimenti
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- Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Caratterizzazione funzionale della mandorla dei semi di mango (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
- "Biureto." Wikipedia, l'enciclopedia libera. 19 giugno 2019, 16:37 UTC. 26 giu 2019, 22:18
- Fuentes F, Quispe I, García J. Standardizzazione del metodo Biuret per quantificare le proteine totali nel siero antibotropico polivalente prodotto presso il Centro nazionale per i prodotti biologici dell'INS. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Disponibile su: repositorio.ins.gob.pe
- Winer Laboratories. Proteine totali. Metodo colorimetrico per la determinazione delle proteine totali nel siero e nel plasma. Disponibile su: wiener-lab.com.ar