- Base
- Peptoni ed estratto di lievito
- Glucosio
- L-lisina
- Indicatore di pH (viola bromocresolo)
- Citrato ferrico di ammonio e tiosolfato di sodio
- Interpretazione del test
- Decarbossilazione della lisina
- Deaminazione della lisina
- Produzione di idrogeno solforato (H.
- Registrazione dei risultati
- Preparazione
- applicazioni
- Riferimenti
L' agar LIA (Lysine Iron) è un test biochimico utilizzato per identificare i batteri della famiglia delle Enterobacteriaceae. Questo mezzo è stato creato da Edwards e Fife, sulla base della formula Falkow.
Originariamente questo test era un brodo contenente peptoni, estratto di lievito, glucosio, L-lisina, viola di bromocresolo e acqua distillata. Edwards e Fife hanno aggiunto agar-agar, citrato di ammonio ferrico e tiosolfato di sodio.
Test positivo e negativo per la decarbossilazione della lisina. Fonte: foto e diagramma di proprietà dell'autore MSc. Marielsa gil
Il test consiste essenzialmente nel dimostrare la presenza dell'enzima lisina decarbossilasi, in grado di reagire con il gruppo carbossilico dell'amminoacido L-lisina. Può verificarsi anche una deaminazione dell'amminoacido a causa della presenza dell'enzima lisina deaminasi.
Inoltre, la composizione del terreno mostra la capacità di alcuni generi batterici di produrre idrogeno solforato. Infine, è anche possibile osservare la generazione o meno di gas nel mezzo.
Base
Peptoni ed estratto di lievito
Come la maggior parte dei terreni di coltura, Lysine Iron Agar contiene componenti che forniscono la fonte di nutrienti necessari per la crescita batterica. Questi componenti sono rappresentati da peptoni ed estratto di lievito.
Glucosio
Allo stesso modo, questo agar contiene glucosio come carboidrato fermentabile. Tutti i batteri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono noti per fermentare il glucosio.
Questo passaggio è fondamentale, perché sarà responsabile dell'acidificazione del terreno, condizione essenziale affinché l'enzima lisina decarbossilasi -se presente- agisca sul suo substrato.
In alcuni generi batterici si può osservare la produzione di gas dovuta alla fermentazione del glucosio.
Il gas è evidenziato quando c'è uno spostamento dell'agar nella provetta, lasciando uno spazio vuoto sul fondo della provetta, o dalla frattura del mezzo in due o più porzioni.
L-lisina
Una volta che la lisina è decarbossilata, si formano una diammina (cadaverina) e anidride carbonica.
La decarbossilazione avviene in presenza del coenzima piridossal fosfato. Questa reazione è irreversibile.
Indicatore di pH (viola bromocresolo)
Tutti i cambiamenti di pH che si verificano nel mezzo dalle varie reazioni vengono rilevati dall'indicatore di pH viola bromocresolo.
In questo senso, quando c'è acidificazione il mezzo diventa giallo, e quando c'è alcalinizzazione il mezzo ritorna al colore viola o viola originale.
Quando si verifica la deaminazione della lisina per la presenza dell'enzima lisina deaminasi, sulla superficie si forma un colore rossastro, tipico dei generi Proteus, Providencia e alcune specie di Morganella.
Ciò è dovuto al fatto che durante il processo di deaminazione si forma l'acido alfa-cheto-carbonico, che reagisce con il citrato di ammonio in presenza di ossigeno, che provoca il suddetto colore.
Citrato ferrico di ammonio e tiosolfato di sodio
D'altra parte, i batteri che producono idrogeno solforato saranno evidenziati dalla presenza di tiosolfato di sodio (fonte di zolfo) e citrato di ammonio ferrico, che è lo sviluppatore di H 2 S.
I batteri che hanno l'enzima tiosolfato reduttasi hanno la capacità di agire riducendo il tiosolfato di sodio presente, formando solfito e idrogeno solforato (H 2 S).
Quest'ultimo è un gas incolore, ma reagendo con il sale di ferro forma solfuro metallico ferroso, che è un composto insolubile (precipitato nero visibile).
Tuttavia, la capacità di formare H 2 S con questo terreno non è molto affidabile, perché alcuni batteri lisina decarbossilasi negativi in grado di produrre H 2 S non formeranno il precipitato nero, poiché l'acidità del mezzo interferisce. Pertanto, si consiglia di verificare con altri supporti che contengono ferro.
Interpretazione del test
Decarbossilazione della lisina
Le provette devono essere lette dopo le 24 ore di incubazione, altrimenti c'è il rischio di interpretare male la reazione, riportando falsi negativi.
Va ricordato che la prima reazione che avverrà sarà la fermentazione del glucosio, quindi tutte le provette dopo 10-12 ore diventeranno gialle.
Se al termine del tempo di incubazione (24 ore) si osserva uno sfondo giallo con una superficie viola o viola, la reazione è negativa. Il colore viola della superficie corrisponde all'alcalinizzazione del mezzo mediante l'uso di peptoni.
Una reazione positiva è quella in cui il fondo e la superficie del tubo sono completamente viola, cioè ritorna al colore originale.
Pertanto, chi determina la positività del test è la base o lo sfondo del mezzo. In caso di dubbio sul colore, può essere paragonato a una provetta LIA non inoculata.
Deaminazione della lisina
Un tubo che mostra la deaminazione della lisina avrà una superficie marrone rossiccia e uno sfondo giallo (acido) o l'intero tubo marrone rossiccio.
Questa reazione è interpretata come negativa per la decarbossilazione della lisina, ma positiva per la deaminazione della lisina.
Questa reazione è definita e interpretata sulla lunetta.
Produzione di idrogeno solforato (H.
Una reazione positiva è osservata dalla comparsa di un precipitato nero in tutto o in parte del mezzo. Di solito tra il bordo della smussatura e la base.
Se il precipitato si verifica in tutta la provetta, non rivelerà le altre reazioni che si verificano nel mezzo.
Registrazione dei risultati
Quando si interpreta il test, i risultati vengono registrati come segue:
Prima viene letto lo smusso, quindi il fondo o il blocco, quindi la produzione di H 2 S e infine la produzione di gas.
Esempio: K / A + (-). Questo significa:
- K: lunetta alcalina (colore viola)
- A: Sfondo acido (giallo), cioè reazione di decarbossilazione negativa e deaminazione negativa.
- +: Produzione di idrogeno solforato
- (-): Senza gas.
Preparazione
Pesare 35 g del terreno di lisina agar ferro disidratato e scioglierlo in un litro di acqua distillata.
Riscaldare fino a quando l'agar si scioglie completamente, per fare questo fate bollire per un minuto, mescolando spesso. Distribuire 4 ml del terreno in 13/100 provette con tappi di cotone.
Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Togliere dall'autoclave e lasciare riposare ad angolo in modo che ci sia una base profonda e uno smusso corto.
Conservare in frigorifero 2-8 ° C. Lascia che si riscaldi prima di seminare il ceppo batterico.
Il colore del terreno disidratato è beige e il terreno preparato è viola rossastro.
Il pH finale del mezzo preparato è 6,7 ± 0,2
Il mezzo diventa giallo a pH 5,2 o inferiore ed è viola a pH 6,5 e superiore.
applicazioni
Questo test, insieme ad altri test biochimici, viene utilizzato per l'identificazione dei bacilli della famiglia delle Enterobacteriaceae.
Il terreno viene seminato con un cappio o un ago diritto, una o due forature vengono praticate sul fondo del tubo e quindi la superficie del mezzo viene incisa a zigzag.
Incubare per 24 ore a 35-37 ° C in aerobiosi. Se necessario si lascia incubare per altre 24 ore.
È utile principalmente per differenziare le specie Citrobacter lattosio-negative da Salmonellas sp.
Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
Riferimenti
- Mac Faddin J. (2003). Test biochimici per l'identificazione di batteri di importanza clinica. 3a ed. Editoriale Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosi microbiologica. 5a ed. Editoriale Panamericana SA Argentina.
- Britannia Laboratories. Agar ferro lisina. 2015 Disponibile su: britanialab.com
- BD Laboratories. Slant BBL Lysine Iron Agar. 2007. Disponibile su: bd.com
- Valtek Laboratories. Medium LIA 2009, disponibile su: andinamedica.com