AGAR DI FARINA DI MAIS: SFONDO, PREPARAZIONE E UTILIZZO - BIOLOGIA - 2024

L' agar di farina di mais è un terreno di coltura solido, a basso potere nutritivo, utile per la subcoltura di alcuni funghi e per dimostrare la presenza di clamidospore nei ceppi del complesso di Candida albicans. In inglese è noto come Corn Meal Agar.

Il terreno per farina di mais convenzionale ha una composizione molto semplice, contiene farina di mais, agar-agar e acqua. A causa del suo basso livello nutritivo, è ideale per l'uso nel mantenimento di ceppi fungini per periodi di tempo moderati, in particolare funghi neri.

A. Rappresentazione grafica del Complesso Candida albicans su agar farina di mais. B. Chlamydospore del Complesso di Candida albicans visto al microscopio, formate su agar farina di mais. Fonte: A. GrahamColm / B. A cura di: CDC / Dr. William Kaplan, per gentile concessione: Public Health Image Library.

La sporulazione del complesso Candida albicans è favorita in questo terreno, se si aggiunge l'1% di Tween 80 durante la preparazione dell'agar. La formazione di clamidospore è caratteristica di questa specie e praticamente l'unica che colpisce l'uomo.

Ci sono altre specie che formano clamidospore, ma è improbabile che colpiscano l'uomo, come la Candida australis, presente negli escrementi di pinguino, o C. clausenii, che è un saprofita raramente trovato. Allo stesso modo, eccezionalmente le specie C. stellatoidea e C. tropicalis potrebbero formarli.

D'altra parte, l'aggiunta di glucosio al mezzo di farina di mais favorisce la formazione di pigmenti nei ceppi di Trichophytom rubrum.

È importante notare che ci sono funghi che non formano ife o pseudoife nell'agar di farina di mais, come Cryptococcus neoformans, che differiscono dagli altri generi.

L'agar di farina di mais può essere preparato a casa in laboratorio o possono essere utilizzati anche terreni commerciali.

Base

La farina di mais è il substrato, l'agar è l'agente solidificante e l'acqua è il solvente.

L'agar di farina di mais può essere integrato con tween 80 (sorbitano monooleato o polisorbato poliestere 80). Questo composto riduce la tensione superficiale del mezzo grazie al suo potere emulsionante.

Inoltre crea un ambiente ostile che inibisce la moltiplicazione cellulare esagerata e stimola la crescita delle ife, favorendo anche la produzione di clamidospore; questi ultimi consideravano strutture di resistenza. Questa struttura aiuta nell'identificazione delle specie di Candida albicans.

Da parte sua, il glucosio in questo terreno aumenta la capacità di formazione dei pigmenti di alcuni funghi.

Va notato che il terreno di farina di mais con glucosio non è utile per la dimostrazione di clamidospore nel complesso di Candida albicans.

Preparazione

Preparazione di agar di farina di mais fatta in casa

Pesare 47 g di farina di mais giallo e sciogliere in 500 ml di acqua distillata. Riscaldare a 60 ºC, mescolando la preparazione per un periodo di circa 1 ora. Quindi filtrare su un pezzo di garza e cotone, opzionalmente può essere nuovamente filtrato facendo passare il preparato attraverso una carta da filtro Whatman n. 2.

Portare il volume a 1000 ml con acqua distillata. Aggiungere 17 g di agar-agar, scaldare fino a quando non si scioglie. Autoclavare per 15 minuti a 121 ºC.

Servire in piastre Petri sterili. Conservare in frigorifero.

Il colore del terreno preparato è biancastro con un aspetto grumoso.

Se si desidera preparare la farina di mais con il glucosio alla preparazione sopra descritta, aggiungere 10 g di glucosio.

Agar di farina di mais commerciale

Pesare 17 g del terreno disidratato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. La miscela può essere riscaldata, agitando delicatamente per dissolversi completamente. Sterilizzare in autoclave a 121 ºC, a 15 libbre, per 15 minuti.

Versare in piastre Petri sterili. Lasciate solidificare. Capovolgere e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso. Temperare prima dell'uso.

Il pH dovrebbe essere 6,0 ± 0,2 a 25 ºC.

Agar farina di mais con Tween 80

Per essere conforme alla ISO 18416, l'agar di farina di mais deve essere preparato come segue:

Pesare 65 grammi per litro e aggiungere 10 ml di Tween 80. Scaldare e far bollire per qualche minuto fino a quando non si scioglie, facendo attenzione a non surriscaldare troppo. Sterilizzare a 121 ºC per 15 minuti.

Agar farina di mais con glucosio

Per migliorare il potere cromogenico delle colonie di Trichophyton rubrum e differenziarle da T. mentagrophytes, è possibile aggiungere lo 0,2% di glucosio alla formula originale. Non è necessario assumere Tween 80, poiché il glucosio inibisce la formazione di clamidospore.

Uso

L'utilizzo dell'agar con farina di mais è principalmente destinato allo studio dei ceppi di Candida, favorendone l'identificazione attraverso l'osservazione caratteristica delle clamidospore nelle specie albicans. Cioè, l'uso di questo agar serve come metodo ausiliario per l'identificazione di questi lieviti.

Su questo agar possono svilupparsi specie saprofite e patogene, ma ciascuna forma strutture miceliali caratteristiche. Ad esempio, le specie del genere Torulopsis non producono micelio e si riproducono solo per blastoconidi.

Allo stesso modo, le specie Trichosporon e Geotrichum producono arthroconidia su agar con farina di mais ed è talvolta difficile distinguere tra l'una e l'altra.

Gli artroconidi del genere Geotrichum producono un'estensione delle ife simile a una mazza da hockey.

Anche la produzione di pigmenti utilizzando farina di mais agar integrata con glucosio è utile per l'identificazione di Trichophytom rubrum.

Sown

Colonie sospette di Candida ottenute nel terreno di coltura primario - Agar Sabouraud - da campioni clinici, cosmetici, terreni, tra gli altri, vengono sottocolturate su agar farina di mais. Il terreno viene seminato e incubato a 22 ° C per 24-48 ore. Il tempo di incubazione può essere allungato se necessario.

Dimostrazione di clamidospore

A tal fine, l'agar farina di mais con Tween 80 deve essere inoculato utilizzando la tecnica Dalmau. Questo metodo consiste nel prendere una parte della colonia sospetta con il manico di platino e fare tre tagli paralleli al centro, mantenendo il manico a 45º. I tagli devono essere separati da una distanza di 1 cm l'uno dall'altro.

Successivamente, sulle venature seminate, viene posto un oggetto di copertura precedentemente fiammato, in modo che metà sia coperta e l'altra sia scoperta.

Incubare le piastre seminate a 30 ° C per 48-72 he quindi esaminare al microscopio attraverso il vetrino.

Mantenimento di ceppi fungini

Per il mantenimento dei ceppi, i piatti seminati e coltivati ​​vengono conservati in frigorifero (da 4 a 8 ºC). In questo modo possono durare diverse settimane ed essere utilizzati per scopi didattici o di ricerca.

QA

Per il controllo della sterilità, una piastra viene incubata senza inoculazione a temperatura ambiente, si prevede che non ci sarà crescita o cambiamento di colore.

Per il controllo di qualità, possono essere seminati ceppi noti come: Staphylococcus aureus, ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922, Aspergillus niger ATCC 16404, Candida albicans ATCC 1023, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763.

I risultati attesi sono una parziale inibizione per S. aureus ed E. coli. Mentre è prevista una crescita soddisfacente nel resto dei ceppi.

L'Aspergillus niger cresce con colonie nere e sporulate in un tempo approssimativo di 5 giorni di incubazione.

Colonie di lievito Candida albicans con produzione di clamidospore.

Saccharomyces cerevisiae produce grandi cellule di lievito.

limitazioni

Sul fondo della piastra si forma un precipitato giallo che non deve essere confuso con le colonie.

Riferimenti

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