ENZIMI DI RESTRIZIONE: FUNZIONI, TIPI ED ESEMPI - BIOLOGIA - 2025

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi impiegate da alcuni archaea e batteri per inibire o "limitare" la diffusione dei virus all'interno. Sono particolarmente comuni nei batteri e fanno parte del loro sistema di difesa contro il DNA estraneo noto come sistema di restrizione / modifica.

Questi enzimi catalizzano la scissione del DNA a doppia banda in posizioni specifiche, in modo riproducibile e senza l'uso di energia aggiuntiva. La maggior parte richiede la presenza di cofattori come il magnesio o altri cationi bivalenti, sebbene alcuni richiedano anche ATP o S-adenosil metionina.

Schema di reazione enzimatica di restrizione HindIII (Fonte: Helixitta tramite Wikimedia Commons)

Le endonucleasi di restrizione furono scoperte nel 1978 da Daniel Nathans, Arber Werner e Hamilton Smith, che ricevettero il Premio Nobel per la medicina per la loro scoperta. Il loro nome deriva generalmente dall'organismo in cui vengono osservati per la prima volta.

Tali enzimi sono ampiamente utilizzati nello sviluppo di metodi di clonazione del DNA e in altre strategie di biologia molecolare e ingegneria genetica. Le loro specifiche caratteristiche di riconoscimento delle sequenze e la capacità di tagliare sequenze vicino ai siti di riconoscimento li rendono strumenti potenti nella sperimentazione genetica.

I frammenti generati da enzimi di restrizione che hanno agito su una particolare molecola di DNA possono essere utilizzati per ricreare una "mappa" della molecola originale utilizzando le informazioni sui siti in cui l'enzima taglia il DNA.

Alcuni enzimi di restrizione possono avere lo stesso sito di riconoscimento sul DNA, ma non lo tagliano necessariamente allo stesso modo. Quindi, ci sono enzimi che tagliano lasciando le estremità smussate ed enzimi che tagliano lasciando le estremità coesive, che hanno diverse applicazioni nella biologia molecolare.

Attualmente ci sono centinaia di diversi enzimi di restrizione disponibili in commercio, offerti da diverse case commerciali; Questi enzimi funzionano come forbici molecolari "personalizzate" per scopi diversi.

Caratteristiche

Gli enzimi di restrizione svolgono la funzione opposta delle polimerasi, poiché idrolizzano o rompono il legame estereo all'interno del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti in una catena nucleotidica.

Nella biologia molecolare e nell'ingegneria genetica sono strumenti ampiamente utilizzati per la costruzione di vettori di espressione e clonazione, nonché per l'identificazione di sequenze specifiche. Sono utili anche per la costruzione di genomi ricombinanti e hanno un grande potenziale biotecnologico.

I recenti progressi nella terapia genica fanno attualmente uso di enzimi di restrizione per l'introduzione di particolari geni in vettori che sono veicoli per il trasporto di tali geni in cellule viventi e che probabilmente hanno la capacità di inserirsi nel genoma cellulare per eseguire modifiche permanenti.

Meccanismo di azione

Gli enzimi di restrizione possono catalizzare la scissione del DNA a doppia banda, sebbene alcuni siano in grado di riconoscere sequenze di DNA a banda singola e persino RNA. Il taglio avviene dopo il riconoscimento delle sequenze.

Il meccanismo d'azione consiste nell'idrolisi del legame fosfodiestere tra un gruppo fosfato e un desossiribosio nello scheletro di ciascun filamento di DNA. Molti degli enzimi sono in grado di tagliare nello stesso sito che riconoscono, mentre altri tagliano tra 5 e 9 coppie di basi prima o dopo di esso.

Normalmente questi enzimi tagliano all'estremità 5 'del gruppo fosfato, dando origine a frammenti di DNA con un'estremità 5' fosforile e un'estremità idrossile terminale 3 '.

Poiché le proteine ​​non entrano in contatto diretto con il sito di riconoscimento nel DNA, devono essere traslocate successivamente fino a raggiungere il sito specifico, magari attraverso meccanismi di "scorrimento" sul filamento di DNA.

Durante la scissione enzimatica, il legame fosfodiestere di ciascuno dei filamenti di DNA è posizionato all'interno di uno dei siti attivi degli enzimi di restrizione. Quando l'enzima lascia il sito di riconoscimento e di scissione, lo fa attraverso associazioni transitorie non specifiche.

tipi

Attualmente sono noti cinque tipi di enzimi di restrizione. Ecco una breve descrizione di ciascuno:

Enzimi di restrizione di tipo I.

Questi enzimi sono grandi proteine ​​pentameriche con tre subunità, una per la restrizione, una per la metilazione e una per il riconoscimento della sequenza nel DNA. Queste endonucleasi sono proteine ​​multifunzionali in grado di catalizzare reazioni di restrizione e modificazione, hanno attività ATPasi e anche DNA topoisomerasi.

Enzimi di questo tipo furono le prime endonucleasi ad essere scoperte, furono purificati per la prima volta negli anni '60 e da allora sono stati studiati in modo approfondito.

Gli enzimi di tipo I non sono ampiamente utilizzati come strumento biotecnologico, poiché il sito di scissione può trovarsi a una distanza variabile fino a 1.000 paia di basi dal sito di riconoscimento, il che li rende inaffidabili in termini di riproducibilità sperimentale.

Enzimi di restrizione di tipo II

Sono enzimi composti da omodimeri o tetrameri che tagliano il DNA in siti definiti tra 4 e 8 bp di lunghezza. Questi siti di clivaggio sono tipicamente palindromici, cioè riconoscono sequenze che vengono lette allo stesso modo in entrambe le direzioni.

Molti degli enzimi di restrizione di tipo II nei batteri tagliano il DNA quando riconoscono il suo carattere estraneo, poiché non ha le tipiche modifiche che dovrebbe avere il proprio DNA.

Questi sono gli enzimi di restrizione più semplici poiché non richiedono alcun cofattore diverso dal magnesio (Mg +) per riconoscere e tagliare le sequenze di DNA.

La precisione degli enzimi di restrizione di tipo II nel riconoscere e tagliare sequenze semplici nel DNA in posizioni precise li rende uno dei più utilizzati e indispensabili nella maggior parte dei rami della biologia molecolare.

All'interno del gruppo degli enzimi di restrizione di tipo II ci sono più sottoclassi classificate in base a determinate proprietà che sono uniche per ciascuna di esse. La classificazione di questi enzimi viene effettuata aggiungendo lettere dell'alfabeto, dalla A alla Z dopo il nome dell'enzima.

Alcune delle sottoclassi più note per la loro utilità sono:

Sottoclasse IIA

Sono dimeri di diverse subunità. Riconoscono sequenze asimmetriche e sono utilizzati come precursori ideali per la generazione di enzimi di taglio.

Sottoclasse IIB

Sono costituiti da uno o più dimeri e tagliano il DNA su entrambi i lati della sequenza di riconoscimento. Hanno tagliato entrambi i filamenti di DNA a un intervallo di coppie di basi prima del sito di riconoscimento.

Sottoclasse IIC

Enzimi di questo tipo sono polipeptidi con funzioni di divisione e modifica dei filamenti di DNA. Questi enzimi tagliano entrambi i fili in modo asimmetrico.

Sottoclasse IIE

Gli enzimi di questa sottoclasse sono i più utilizzati nell'ingegneria genetica. Hanno un sito catalitico e generalmente richiedono un effettore allosterico. Questi enzimi devono interagire con due copie della loro sequenza di riconoscimento per eseguire una scissione efficiente. All'interno di questa sottoclasse ci sono gli enzimi EcoRII ed EcoRI.

Enzimi di restrizione di tipo III

Le endonucleasi di restrizione di tipo III sono composte da due sole subunità, una è responsabile del riconoscimento e della modifica del DNA, mentre l'altra è responsabile della scissione della sequenza.

Questi enzimi richiedono due cofattori per la loro funzione: ATP e magnesio. Gli enzimi di restrizione di questo tipo possiedono due siti di riconoscimento asimmetrici, traslocano il DNA in modo dipendente dall'ATP e lo tagliano tra 20-30 bp adiacente al sito di riconoscimento.

Enzimi di restrizione di tipo IV

Gli enzimi di tipo IV sono facili da identificare poiché tagliano il DNA con segni di metilazione, sono costituiti da diverse subunità che sono responsabili del riconoscimento e del taglio della sequenza del DNA. Questi enzimi usano GTP e magnesio bivalente come cofattori.

Siti di scissione specifici includono filamenti nucleotidici con residui di citosina metilati o idrossimetilati su uno o entrambi i filamenti di acidi nucleici.

Enzimi di restrizione di tipo V.

Questa classificazione raggruppa gli enzimi di tipo CRISPER-Cas, che identificano e tagliano sequenze di DNA specifiche da organismi invasori. Gli enzimi Cas utilizzano un filamento di RNA guida sintetizzato CRISPER per riconoscere e attaccare gli organismi invasori.

Gli enzimi classificati come tipo V sono polipeptidi strutturati da enzimi di tipo I, II e II. Possono tagliare sezioni del DNA di quasi tutti gli organismi e con un'ampia gamma di lunghezze. La loro flessibilità e facilità d'uso rendono questi enzimi uno degli strumenti più utilizzati nell'ingegneria genetica oggi, insieme agli enzimi di tipo II.

Esempi

Gli enzimi di restrizione sono stati utilizzati per la rilevazione dei polimorfismi del DNA, specialmente negli studi genetici di popolazione e negli studi evolutivi che utilizzano il DNA mitocondriale, al fine di ottenere informazioni sui tassi di sostituzioni nucleotidiche.

Attualmente, i vettori utilizzati per la trasformazione dei batteri per vari scopi possiedono siti multiclonanti in cui si trovano siti di riconoscimento per più enzimi di restrizione.

Tra questi enzimi i più diffusi sono EcoRI, II, III, IV e V, ottenuti e descritti per la prima volta da E. coli; HindIII da H. influenzae e BamHI da B. amyloliquefaciens.

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