CITOCHIMICA: STORIA, OGGETTO DI STUDIO, UTILITÀ E TECNICHE - BIOLOGIA - 2025

La citochimica comprende una serie di tecniche che si basano sull'identificazione e la disposizione di sostanze specifiche all'interno della cellula. È considerato un ramo della biologia cellulare che combina la morfologia cellulare con la struttura chimica.

Secondo Bensley, fondatore dell'applicazione della citologia moderna, esprime che lo scopo della citochimica è scoprire l'organizzazione chimica delle cellule al fine di comprendere i misteri della vita. Oltre a studiare i cambiamenti dinamici che si verificano durante le diverse fasi funzionali.

1: malattia extramammaria di Paget. (Ematossilina-Eosina) 2: placche senili osservate nella corteccia cerebrale in un paziente con malattia di Alzheimer. (Impregnazione d'argento) 3: lingua di coniglio, fibre di collagene (blu). Fibre muscolari (strisce viola). (Tricromia di Masson). 4: Tessuto epatico con degenerazione grassa. (Sudan III) 5: Fegato infiammato. Necrosi. (Blu toluidina) Fonti: Wikipedia. com / Utente: KGH / File di dominio pubblico / Mohit Lalwani

In questo modo è possibile determinare il ruolo metabolico svolto da queste sostanze all'interno della cellula.

La citochimica utilizza due metodi principali. Il primo si basa su procedure chimiche e fisiche. Queste tecniche ricorrono all'uso del microscopio come strumento indispensabile per visualizzare le reazioni chimiche che avvengono su specifiche sostanze all'interno della cellula.

Esempio: l'uso di coloranti citochimici, come la reazione Feulgen o la reazione PAS, tra gli altri.

Il secondo metodo si basa sulla biochimica e microchimica. Con questa metodologia è possibile determinare quantitativamente la presenza di sostanze chimiche intracellulari.

Tra le sostanze che possono essere rivelate in un tessuto o in una struttura cellulare ci sono le seguenti: proteine, acidi nucleici, polisaccaridi e lipidi.

Storia della citochimica

Le tecniche citochimiche sin dalla loro invenzione hanno aiutato a comprendere la composizione delle cellule e nel tempo sono emerse numerose tecniche che utilizzano vari tipi di coloranti con affinità e fondamentali dissimili.

Successivamente, la citochimica ha aperto nuovi orizzonti con l'uso di determinati substrati per mostrare colorimetricamente la presenza di enzimi o altre molecole all'interno della cellula.

Allo stesso modo, sono emerse altre tecniche come l'immunocitochimica che è stata di grande aiuto nella diagnosi di molte malattie. L'immunocitochimica si basa sulle reazioni antigene-anticorpo.

D'altra parte, la citochimica ha anche utilizzato sostanze fluorescenti chiamate fluorocromi, che sono ottimi marcatori per la rilevazione di alcune strutture cellulari. Per le caratteristiche del fluorocromo evidenzia le strutture a cui è stato applicato.

Cosa Studi?

Le varie tecniche citochimiche utilizzate su un campione biologico hanno qualcosa in comune: rivelano la presenza di uno specifico tipo di sostanza e ne conoscono l'ubicazione all'interno della struttura biologica in esame, sia essa un tipo di cellula o un tessuto.

Queste sostanze possono essere enzimi, metalli pesanti, lipidi, glicogeno e gruppi chimici definiti (aldeidi, tirosina, ecc.).

Le informazioni fornite da queste tecniche possono fornire una guida non solo per l'identificazione delle cellule, ma anche per la diagnosi di varie patologie.

Ad esempio, le macchie citochimiche sono molto utili per differenziare i vari tipi di leucemie, poiché alcune cellule esprimono determinati enzimi o sostanze chiave e altre no.

D'altra parte, va notato che affinché l'uso della citochimica sia possibile, devono essere prese le seguenti considerazioni:

1) La sostanza deve essere immobilizzata nel luogo in cui si trova naturalmente.

2) La sostanza deve essere identificata utilizzando substrati che reagiscono specificamente con essa e non con altri composti.

Utilità

I campioni che possono essere studiati tramite tecniche citochimiche sono:

- Sangue periferico esteso.

- Midollo osseo esteso.

- Tessuti fissati per tecniche istochimiche.

- Cellule fissate mediante citocentrifugazione.

Le tecniche citochimiche sono di grande aiuto nell'area dell'ematologia, poiché sono ampiamente utilizzate per aiutare nella diagnosi e differenziazione di alcuni tipi di leucemie.

Ad esempio: le reazioni esterasi vengono utilizzate per differenziare la leucemia mielomonocitica dalla leucemia monocitica acuta.

Il midollo osseo e gli strisci di sangue periferico di questi pazienti sono simili, poiché alcune cellule sono difficili da identificare morfologicamente da sole. Per questo, viene eseguito il test dell'esterasi.

Nel primo le esterasi specifiche sono positive, mentre nel secondo le esterasi aspecifiche sono positive.

Sono anche molto utili in istologia, poiché, ad esempio, l'uso della tecnica di colorazione dei metalli pesanti (impregnazione d'argento) colora le fibre reticolari di un colore marrone intenso nel tessuto miocardico.

Tecniche in citochimica

Di seguito verranno spiegate le tecniche più utilizzate:

- Uso di coloranti

Le colorazioni utilizzate sono molto diverse nelle tecniche citochimiche e queste possono essere classificate in base a diversi punti di vista:

Secondo il radicale per il quale hanno affinità

Si dividono in: acidi, basici o neutri. Sono le più semplici e le più utilizzate nella storia, permettendoci di distinguere le componenti basofile da quelle acidofile. Esempio: colorazione con ematossilina-eosina.

In questo caso, i nuclei delle cellule si colorano di blu (assumono l'ematossilina, che è la colorazione di base) e i citoplasma, di rosso (prendono l'eosina, che è la macchia acida).

Secondo il colore che forniscono

Possono essere ortocromatici o metacromatici. Gli ortocromatici sono quelli che macchiano le strutture dello stesso colore che ha il colorante. Ad esempio, il caso dell'eosina, il cui colore è rosso e si colora di rosso.

D'altra parte, i metacromatici colorano strutture di un colore diverso dal loro, come la toluidina, il cui colore è blu e tuttavia macchia viola.

Coloranti vitali o sopravitali

Sono coloranti innocui, cioè colorano le cellule e rimangono in vita. Queste macchie sono chiamate vitali (es. Blu trypan per colorare i macrofagi) o sopraravitali (es. Verde Janus per colorare i mitocondri o rosso neutro per colorare i lisosomi).

- Rilevazione dei lipidi mediante coloranti liposolubili

Tetrossido di osmio

Colora di nero i lipidi (acidi grassi insaturi). Questa reazione può essere osservata con il microscopio ottico, ma poiché questo colorante è di alta densità può anche essere visualizzato con un microscopio elettronico.

Sudan III

È uno dei più utilizzati. Questo colorante si diffonde e si solubilizza nei tessuti, accumulandosi all'interno delle goccioline lipidiche. Il colore è rosso scarlatto.

Macchia nera del Sudan B

Produce un contrasto migliore dei precedenti perché è in grado di sciogliersi anche nei fosfolipidi e nel colesterolo. È utile per rilevare granuli azurofilici e specifici di granulociti maturi e dei loro precursori. Pertanto identifica le leucemie mieloidi.

- Colorazione del gruppo aldeidico (colorazione di Schiff con acido periodico)

La colorazione di Schiff con acido periodico può rilevare tre tipi di gruppi aldeidici. Loro sono:

- Aldeidi libere, naturalmente presenti nei tessuti (reazione al plasma).

- Aldeidi prodotte per ossidazione selettiva (reazione PAS).

- Aldeidi generate dall'idrolisi selettiva (reazione di Feulgen).

Reazione PAS

Questa colorazione si basa sul rilevamento di alcuni tipi di carboidrati, come il glicogeno. L'acido periodico Schiff rompe i legami CC dei carboidrati a causa dell'ossidazione dei gruppi glicolici 1-2, riuscendo a liberare i gruppi aldeidici.

I gruppi aldeidici liberi reagiscono con il reagente di Schiff e formano un composto rosso porpora. L'aspetto del colore rosso porpora mostra una reazione positiva.

Questo test è positivo nelle cellule vegetali, rilevando amido, cellulosa, emicellulosa e peptine. Mentre nelle cellule animali rileva mucine, mucoproteine, acido ialuronico e chitina.

Inoltre, è utile nella diagnosi di leucemie linfoblastiche o eritroleucemia, tra le altre patologie di tipo mielodisplastico.

Nel caso di carboidrati acidi, può essere utilizzata la colorazione blu alcian. Il test è positivo se si osserva un colore azzurro / turchese.

Reazione plasmatica

La reazione del plasma rivela la presenza di alcune aldeidi alifatiche a catena lunga come la palma e lo stearale. Questa tecnica viene applicata su sezioni istologiche congelate. Viene trattato direttamente con il reagente di Schiff.

Reazione di Feulgen

Questa tecnica rileva la presenza di DNA. La tecnica consiste nel sottoporre il tessuto fissato ad una debole idrolisi acida per farlo successivamente reagire con il reagente di Schiff.

L'idrolisi espone i gruppi aldeidici desossiribosio al legame desossiribosio-purina. Il reagente di Schiff reagisce quindi con i gruppi aldeidici lasciati liberi.

Questa reazione è positiva nei nuclei e negativa nei citoplasmi delle cellule. La positività è evidenziata dalla presenza di un colore rosso.

Se questa tecnica è combinata con metil verde-pironina, è possibile rilevare simultaneamente DNA e RNA.

- Coloranti citochimici per strutture proteiche

Per questo, può essere utilizzata la reazione Millon, che utilizza il nitrato di mercurio come reagente. Le strutture contenenti amminoacidi aromatici si colorano di rosso.

- Macchie citochimiche che utilizzano substrati per mostrare la presenza di enzimi

Queste colorazioni si basano sull'incubazione del campione biologico con un substrato specifico e il prodotto di reazione reagisce successivamente con i sali diazo per formare un complesso colorato.

esterasi

Questi enzimi sono presenti nei lisosomi di alcune cellule del sangue e sono in grado di idrolizzare gli esteri organici rilasciando naftolo. Quest'ultimo forma un colorante azoico insolubile quando si lega a un sale diazo, macchiando il sito in cui si verifica la reazione.

Esistono diversi substrati e, a seconda di quale viene utilizzato, è possibile identificare esterasi specifiche e esterasi aspecifiche. I primi sono presenti nelle cellule immature della serie mieloide e i secondi nelle cellule di origine monocitica.

Il substrato utilizzato per la determinazione delle esterasi specifiche è: naftolo-AS-D cloroacetato. Mentre per la determinazione di esterasi aspecifiche possono essere utilizzati diversi substrati come naftolo AS-D acetato, alfa naftil acetato e alfa naftil butirrato.

In entrambi i casi le cellule si coloreranno di un rosso intenso quando la reazione è positiva.

mieloperossidasi

Questo enzima si trova nei granuli azurofilici delle cellule granulocitiche e dei monociti.

La sua rilevazione viene utilizzata per differenziare le leucemie di origine mieloide da quelle linfoidi. Le cellule contenenti mieloperossidasi diventano giallo ocra.

fosfatasi

Questi enzimi rilasciano acidi fosforici da diversi substrati. Differiscono tra loro in base alla specificità del substrato, al pH e all'azione di inibitori e inattivatori.

Tra le più note vi sono le fosfomonoesterasi che idrolizzano gli esteri semplici (PO). Esempio: fosfatasi alcalina e fosfatasi acida, nonché fosfamidasi che idrolizzano i legami (PN). Questi sono usati per differenziare le sindromi linfoproliferative e per la diagnosi della leucemia a cellule capellute.

- Colorazioni tricromiche

Trichrome Mallary-Azan

Sono utili per differenziare il citoplasma delle cellule dalle fibre del tessuto connettivo. Le cellule si colorano di rosso e le fibre di collagene di blu.

Tricromia di Masson

Ha la stessa utilità del precedente ma, in questo caso, le cellule si colorano di rosso e le fibre di collagene sono verdi.

- Coloranti che macchiano specifici organelli

Janus Green

Colora selettivamente i mitocondri.

Sali d'argento e acido osmico

Colora l'apparato di Golgi.

Blu di toluidina

Macchia i corpi di Nissi

Sali d'argento e PAS

Macchiano le fibre reticolari e la lamina basale.

Orceina e resorcina fucsina

Tingono le fibre elastiche. Con la prima si tingono di marrone e con la seconda di blu intenso o viola.

- Altre tecniche utilizzate in citochimica

Uso di sostanze fluorescenti o fluorocromi

Esistono tecniche che utilizzano sostanze fluorescenti per studiare la posizione di una struttura in una cellula. Queste reazioni vengono visualizzate con uno speciale microscopio chiamato fluorescenza. Esempio: tecnica IFI (Immunofluorescenza indiretta).

Rilevazione di componenti cellulari mediante immunocitochimica

Queste tecniche sono molto utili in medicina in quanto aiutano a rilevare una certa struttura cellulare e anche a quantificarla. Questa reazione si basa su una reazione antigene-anticorpo. Ad esempio: tecniche ELISA (Enzyme Immuno Assay).

raccomandazioni

- È necessario utilizzare strisci di controllo per valutare le buone prestazioni dei coloranti.

- Strisci freschi dovrebbero essere usati per subire la colorazione citochimica. Se non possibile, devono essere conservati al riparo dalla luce e conservati a 4 ° C.

- Bisogna fare attenzione che il fissativo utilizzato non influenzi negativamente la sostanza da indagare. In altre parole, deve essere impedito di poterlo estrarre o inibire.

- Il tempo di utilizzo dei fissativi deve essere rispettato, poiché in generale dovrebbe durare solo pochi secondi, poiché esporre più a lungo lo striscio al fissativo può danneggiare alcuni enzimi.

Riferimenti

1. "Citochimica." Wikipedia, l'enciclopedia libera. 30 giugno 2018, 17:34 UTC. 9 Jul 2019, 02:53 Disponibile su: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metodi di impregnazione metallica per lo studio delle fibre reticolari del miocardio: studio comparativo. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponibile su: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T.Citochimica della fosfatasi acida: considerazioni metodologiche. Rev Diagn Biol.200; 50 (2): 89-92. Disponibile su: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologia cellulare e molecolare. 11a edizione. Editoriale Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Strumenti classici per lo studio della biologia cellulare. TP 1 (materiale supplementare) - Biologia cellulare. Disponibile su: dbbe.fcen.uba.ar