COLORAZIONE EMATOSSILINA-EOSINA: CARATTERISTICHE, USI, TECNICHE - CHIMICA - 2026

L' ematossilina - eosina è una tecnica di colorazione che utilizza la combinazione dei coloranti ematossilina ed eosina. Questa coppia di coloranti costituisce una coppia perfetta, poiché l'ematossilina agisce come un colorante di base e l'eosina è un colorante acido.

La designazione di coloranti basici o acidi non si riferisce al pH ottenuto in soluzione, ma parla piuttosto della proporzione prevalente in termini di cariche anioniche o cationiche che possiedono o dalla posizione del gruppo cromoforo.

Epitelio colonnare ciliato colorato con ematossilina - eosina (HE) Fonte: Todd Straus e Vladimir Osipov

In questo senso, l'ematossilina è considerata un colorante basico (cationico) e quindi ha un'affinità per le strutture acide, come il nucleo delle cellule. Mentre l'eosina, essendo un colorante acido (anionico), ha un'affinità per le strutture alcaline o basiche, come il citoplasma cellulare.

Per questo motivo, questa combinazione di coloranti è ampiamente utilizzata per la colorazione dei tessuti, poiché consente di distinguere chiaramente nuclei e citoplasma. I nuclei si colorano di blu scuro o viola e il citoplasma di rosa.

La colorazione con ematossilina-eosina è una delle tecniche di colorazione più utilizzate nell'area dell'istologia e della citologia, grazie alla sua facile manipolazione e al basso costo. Viene utilizzato per visualizzare le cellule, le fibre nervose spesse e la presenza di alcuni microrganismi nei tessuti, come: parassiti, funghi e batteri, tra gli altri.

caratteristiche

Ematossilina

L'ematossilina è un colorante neutro. Tuttavia, il componente che fornisce il colore (cromoforo) si trova nel centro cationico o basico della molecola. Da qui la sua affinità per le strutture acide. La sua formula chimica è C ₁₆ H ₁₄ O ₆ e il suo nome scientifico è 7,11b-diidroindeno cromene-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentolo.

Colora principalmente i nuclei delle cellule, poiché sono molto ricchi di acidi nucleici. Può anche macchiare inclusioni citoplasmatiche di origine virale.

Affinché l'ematossilina possa macchiarsi, deve essere in uno stato ossidato e legata a un metallo. Quest'ultimo servirà a fissarsi al tessuto, cioè agirà come un mordente.

Quando l'ematossilina è ossidata si chiama emateina. L'ossidazione si ottiene con l'esposizione all'ossigeno (invecchiamento) del reagente o con sostanze che ne aiutano l'ossidazione (ossidazione chimica).

Eosina

L'eosina è un colorante che si colora di rosso o rosa. È insolubile in acqua sebbene esista una versione solubile in acqua. Generalmente, l'eosina viene preparata sciogliendola in alcool (etanolo a 95 °).

Colora citoplasmi, fibre muscolari, organelli citoplasmatici e collagene, ma non macchia i nuclei cellulari. Questo perché è caricato negativamente, quindi ha un'affinità per le strutture caricate positivamente.

Esistono due tipi di eosina "Y" e "B". L'eosina "Y" è nota come eosina gialla. Il suo nome scientifico è tetrabromo fl uoresceina e la sua formula chimica è C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅ .

D'altra parte, l'eosina "B" è talvolta chiamata eritrosina B. bluastra. Il suo nome scientifico è dibromodynitro fl uoresceina e la formula è C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉ . Entrambi sono molto simili e la differenza tra l'utilizzo dell'uno o dell'altro non è davvero evidente. Tuttavia, il più popolare è l'eosina "Y".

L'eosina ha la proprietà di distinguere tra una cellula vivente e una morta, poiché è in grado di attraversare la membrana per macchiarne il citoplasma solo quando le cellule sono morte, lasciando il citoplasma della cellula incolore se rimane in vita.

applicazioni

Colorazione delle fibre nervose

Le fibre nervose spesse possono essere colorate e identificate con ematossilina-eosina. Tuttavia, non è utile per colorare le fibre nervose sottili, poiché è necessaria una colorazione d'argento per visualizzare queste ultime.

Macchie istologiche sulla sezione della pelle

Nella colorazione dello strato corneo della pelle, il colorante che agisce è l'eosina, poiché a questo livello le cellule non hanno un nucleo.

Nello strato granulare della pelle, l'ematossilina colora fortemente i granuli di cheratoialina all'interno delle cellule dei granuli. Al contrario, lo strato spinoso della pelle è debolmente macchiato di ematossilina, mentre lo strato basale o germinale è piuttosto macchiato.

L'eosina colora il citoplasma di tutte le cellule e l'intensità del colore può variare da strato a strato.

Colorazione con ematossilina-eosina di campioni di feci

Gómez et al., Nel 2005 hanno dimostrato che la colorazione con ematossilina-eosina era più efficace nell'identificare i casi di amebiasi dovuti a Entamoeba histolytica ed Entamoeba dispar rispetto al metodo di visualizzazione fresca (soluzione salina e lugol) in pazienti con malattia diarroica acuta.

È stato anche dimostrato che è altamente sensibile nel rilevare l'eritrofagocitosi (amebe che hanno inghiottito gli eritrociti).

Colorazione di sezioni istologiche per la diagnosi di infezione

Walwyn et al., Nel 2004 hanno proposto l'uso di coloranti istologici per rilevare i microrganismi che causano infezioni.

Utilizzando la colorazione con ematossilina-eosina, sono stati in grado di visualizzare le infezioni causate da Clostridium, Actinomyces, Spirillae o Candida. Sono stati inoltre in grado di osservare la presenza del parassita Sarcoptes escabiei in sezioni di pelle e inclusioni virali da citomegalovirus ed herpes in sezioni di vari tessuti.

tecniche

Per campioni istologici

La colorazione della sezione istologica passa attraverso una serie di passaggi. La prima cosa è ottenere la sezione istologica. Questa deve essere cerata per ottenere successivamente i tagli (ultrafini) con un microtomo. La tecnica consiste nei seguenti passaggi:

1-Eliminazione della paraffina in eccesso : per questo puoi usare xilolo o Heme-D, immergere per 3-5 minuti.

2-Reidratazione del campione: si ottiene immergendo il campione in diverse concentrazioni di alcoli (etanolo) in ordine decrescente (100 °, 90 °, 70 °). In tutti i casi per 7 minuti.

3-Eliminazione dell'alcool in eccesso: per questo si immerge in acqua per 7 minuti.

4-Colorazione con ematossilina: il campione viene immerso per 6-10 minuti in un vassoio contenente ematossilina. Il tempo di esposizione dipende dalle dimensioni e dallo spessore del campione.

5-Eliminazione dell'ematossilina in eccesso: si lava con acqua per 5 minuti e poi si effettua un rapido passaggio (10-20 secondi) tramite alcool acido. Successivamente viene nuovamente lavato con acqua per 5 minuti. Quindi viene immerso in etanolo a 96 ° per 1 minuto.

6-Colorazione con eosina: per questo, il campione viene immerso per 5 minuti nel vassoio eosina.

7-Disidratazione del campione : per fare questo, passa attraverso i vassoi alcolici (etanolo), ma questa volta in ordine crescente. (70 °, 90 °, 100 °). (Per 5 secondi, 5 secondi, 1 minuto rispettivamente).

8-Chiarificazione del campione : per questo viene esposto a xilolo per 5-10 minuti ed essiccato per sigillare definitivamente con balsamo del Canada o altro materiale simile.

Per campioni di feci che cercano

Uno striscio viene eseguito su un vetrino con le feci del paziente e fissato con alcol all'80% per 5 minuti. Il foglio viene immerso in ematossilina per 5 minuti e immediatamente lavato con acqua.

Successivamente, viene rapidamente immerso in alcool acido e quindi in acqua di ammoniaca. Si lava con acqua. Viene colorato per 5 minuti in eosina. Il campione viene disidratato come spiegato nella tecnica anteriore e infine risciacquato con xilene.

Preparazione dei reagenti

- Ematossilina

In un litro di acqua distillata sciogliere 50 grammi di solfato di alluminio di potassio o ammonio. Quando completamente sciolto, aggiungere 1 grammo di ematossilina cristallizzata. Quando si dissolve completamente, 1 g di acido citrico viene aggiunto insieme a 50 g di idrato di cloralio e 0,2 g di iodato di sodio.

Si fa bollire per 5 minuti, quindi si lascia raffreddare e si filtra per eliminare eventuali particelle solide rimaste. Il reagente così preparato può essere utilizzato immediatamente.

- Eosina

Può essere preparato con una base alcolica oppure con una base acqua.

Eosina alcolica

In 100 ml di etanolo a 95 ° sciogliere 0,5 grammi di eosina "Y". Quindi aggiungere qualche goccia di acido acetico glaciale.

Eosina acquosa al 2%

In 1250 ml di acqua distillata sciogliere 25 grammi di eosina idrosolubile "Y". Quindi aggiungere qualche goccia di acido acetico glaciale.

Alcol acido

Misurare 0,5 ml di acido cloridrico concentrato e portare a 100 ml con alcool assoluto.

Acqua di ammoniaca

Misurare 0,5 mL di ammoniaca concentrata e portare a 100 mL con acqua distillata.

Riferimenti

1. Navarrete, G. Istologia della pelle. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. Disponibile su: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identificazione di Entamoeba histolytica / E. Dispar dalla tecnica dell'ameba fresca rispetto alla sua colorazione con ematossilina-eosina nella diarrea acuta. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. Disponibile su: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Utilità delle tecniche istologiche per la diagnosi di infezione in campioni anatomici. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). Disponibile su: scielo.sld
5. PanReac AppliChem ITW Reagents. Colorazione ematossilina-eosina. 2017, Spagna. Disponibile su: itwreagents.com
6. Eosina. Wikipedia, l'enciclopedia libera. 7 novembre 2018, 08:18 UTC. 4 agosto 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. "Ematossilina". Wikipedia, l'enciclopedia libera. 3 maggio 2019, 11:23 UTC. 4 agosto 2019, 22:48 wikipedia.org